مروری بر روند توسعه سیستم اصلاح ژنی کریسپر از ابتدا تاکنون

پنج‭ ‬سال‭ ‬پیش‭ ‬دانشمندان‭ ‬در‭ ‬گزارش‌های‭ ‬مهیجی‭ ‬اعلام‭ ‬کردند‭ ‬تکنولوژی‭ ‬کریسپر‭ ‬توانایی‭ ‬ویرایش‭ ‬دقیق‭ ‬و‭ ‬بهینه‌ی‭ ‬ژنوم‭ ‬در‭ ‬سلول‌های‭ ‬یوکاریوتی‭ ‬را‭ ‬دارد. از‭ ‬آن‭ ‬زمان‭ ‬تاکنون‭ ‬صد‌ها‭ ‬مؤسسه‌ی‭ ‬تحقیقاتی‭ ‬بودجه‌های‭ ‬عظیمی‭ ‬برای‭ ‬بررسی‭ ‬کارکرد‭ ‬این‭ ‬تکنولوژی‭ ‬در‭ ‬علوم‭ ‬گوناگون‭ ‬از‭ ‬جمله‭ ‬پزشکی‭ ‬و‭ ‬کشاورزی‭ ‬صرف‭ ‬کرده‌اند. اکنون‭ ‬به‌سختی‭ ‬می‌توان‭ ‬انقلابی‭ ‬را‭ ‬در‭ ‬علم‭ ‬یافت‭ ‬که‭ ‬زیست‌شناسی‭ ‬را‭ ‬به‭ ‬اندازه‌ی‭ ‬کریسپر‭ ‬تحت‭ ‬تأثیر‭ ‬قرار‭ ‬داده‭ ‬باشد. تنها‭ ‬چند‭ ‬سال‭ ‬قبل‭ ‬دانشمندان‭ ‬اعلام‭ ‬کردند‭ ‬سیستمی‭ ‬که‭ ‬توسط‭ ‬باکتری‌ها‭ ‬علیه‭ ‬تهاجم‭ ‬ویروسی‭ ‬مورد‭ ‬استفاده‭ ‬قرار‭ ‬می‌گیرد‭ ‬قابلیت‭ ‬هدف‌گیری‭ ‬نقاط‭ ‬خاصی‭ ‬از‭ ‬DNA‭ ‬را‭ ‬داشته‭ ‬و‭ ‬می‌توان‭ ‬از‭ ‬آن‭ ‬برای‭ ‬ویرایش‭ ‬ژنوم‭ ‬سلول‌های‭ ‬یوکاریوتی‭ ‬از‭ ‬جمله‭ ‬پستانداران‭ ‬استفاده‭ ‬نمود.

در‭ ‬مدتی‭ ‬کوتاه‭ ‬پس‭ ‬از‭ ‬کشف‭ ‬این‭ ‬مکانیسم،‭ ‬کارکرد‌های‭ ‬فراوانی‭ ‬برای‭ ‬آن‭ ‬ابداع‭ ‬شد. از‭ ‬جمله‌ی‭ ‬مهم‌ترینِ‭ ‬آن‌ها،‭ ‬ساخت‭ ‬مدل‌های‭ ‬حیوانی‭ ‬پیچیده‭ ‬از‭ ‬بیماری‌های‭ ‬وراثتی‭ ‬انسانی‭ ‬و‭ ‬سرطان‌ها‭ ‬بود. همچنین‭ ‬اسکن‌های‭ ‬ژنومیِ‭ ‬سلول‌های‭ ‬انسان‭ ‬جهت‭ ‬یافتن‭ ‬میزان‭ ‬بیان‭ ‬ژن‭ ‬از‭ ‬دستاورد‌های‭ ‬مهم‭ ‬انقلاب‭ ‬کریسپر‭ ‬به‭ ‬شمار‭ ‬می‌آید. با‭ ‬این‭ ‬حال‭ ‬پیشرفت‌های‭ ‬حاصل‭ ‬شده‭ ‬در‭ ‬این‭ ‬حوزه‭ ‬موضوعات‭ ‬اخلاقی‭ ‬فراوانی‭ ‬را‭ ‬به‭ ‬پیش‭ ‬کشیده‭ ‬است‭.‬

کشف‭ ‬کریسپر

داستان‭ ‬کریسپر‭ ‬در‭ ‬کاستا‭ ‬بلانکای‭ ‬اسپانیا‭ ‬کلید‭ ‬می‌خورد. فرانسیسکو‭ ‬موجیکا‭ (‬Francisco Mojica‭) ‬در‭ ‬سال ‭ ‬۱۹۸۹‭ ‬تحصیلات‭ ‬دوره‌ی‭ ‬دکترای‭ ‬خود‭ ‬را‭ ‬در‭ ‬دانشگاه‭ ‬آلیکانته‭ (‬Alicante‭) ‬آغاز‭ ‬کرده‭ ‬و‭ ‬در‭ ‬آزمایشگاهی‭ ‬مشغول‭ ‬پژوهش‭ ‬بر‭ ‬روی‭ ‬آرکی‌باکتری‭ ‬مقاوم‭ ‬به‭ ‬نمک‭ ‬در‭ ‬مرداب‌های‭ ‬محلی‭ ‬شد‭.‬

استاد‭ ‬راهنمای‭ ‬موجیکا‭ ‬دریافت،‭ ‬غلظت‭ ‬نمک‭ ‬موجود‭ ‬در‭ ‬محیط‭ ‬کشت‭ ‬باکتری‭ ‬بر‭ ‬روی‭ ‬فعالیت‭ ‬برش‌دهنده‌ی‭ ‬آنزیم‌های‭ ‬محدودکننده‭ ‬تأثیر‭ ‬می‌گذارد. موجیکا‭ ‬در‭ ‬ادامه‭ ‬به‭ ‬بررسی‭ ‬قطعات‭ ‬تغییریافته‭ ‬پرداخت. در‭ ‬اولین‭ ‬قطعه‌ی‭ ‬DNA‭ ‬مورد‭ ‬بررسی،‭ ‬نسخه‌های‭ ‬متعدد‭ ‬و‭ ‬کاملی‭ ‬از‭ ‬توالی‌های‭ ‬به‌شدت‭ ‬پالیندرومیک‭ ‬و‭ ‬نادر‭ ‬با‭ ‬طول‭ ‬۳۰‭ ‬باز‭ ‬یافت‭ ‬شد. این‭ ‬توالی‌ها‭ ‬بین‭ ‬گروه‭ ‬دیگری‭ ‬از‭ ‬توالی‌های‭ ‬فاصله‌انداز‭ ‬با‭ ‬طول‭ ‬۳۶‭ ‬باز‭ ‬قرار‭ ‬گرفته‭ ‬بودند. موجیکا‭ ‬این‭ ‬یافته‌ها‭ ‬را‭ ‬بسیار‭ ‬عجیب‭ ‬و‭ ‬جذاب‭ ‬یافت‭ ‬و‭ ‬دهه‌های‭ ‬بعدی‭ ‬پژوهش‭ ‬خود‭ ‬را‭ ‬به‭ ‬پرده‌برداری‭ ‬از‭ ‬راز‭ ‬این‭ ‬پدیده‭ ‬اختصاص‭ ‬داد‭.‬

مدتی‭ ‬بعد‭ ‬موجیکا‭ ‬توالی‌های‭ ‬مشابه‭ ‬دیگری‭ ‬را‭ ‬در‭ ‬باکتری‭ ‬H.volcanii‭ ‬و‭ ‬سایر‭ ‬آرکی‌باکتری‌های‭ ‬نمک‌دوست‭ ‬کشف‭ ‬کرد. همزمان‭ ‬با‭ ‬یافته‌های‭ ‬موجیکا،‭ ‬گروهی‭ ‬دیگر‭ ‬از‭ ‬پژوهشگران‭ ‬در‭ ‬ژاپن‌‭ (‬۱۹۸۷‭) ‬توالی‌های‭ ‬مشابه‭ ‬دیگری‭ ‬در‭ ‬باکتری‭ ‬E.Coli‭ ‬کشف‭ ‬نمودند. موجیکا‭ ‬وجود‭ ‬این‭ ‬تناوب‌های‭ ‬شدیداً‭ ‬حفظ‭ ‬شده‭ ‬در‭ ‬گونه‌های‭ ‬باکتریایی‭ ‬دور‭ ‬را‭ ‬نشانه‌ای‭ ‬بر‭ ‬عملکرد‭ ‬کلیدی‭ ‬آن‌ها‭ ‬طی‭ ‬تکامل‭ ‬دانسته‭ ‬و‭ ‬مقاله‌ای‭ ‬مبنی‭ ‬بر‭ ‬کشف‭ ‬کلاس‭ ‬جدیدی‭ ‬از‭ ‬تناوب‌ها‭ ‬در‭ ‬سال‭ ‬۱۹۹۵‭ ‬منتشر‭ ‬نمود.

موجیکا‭ ‬به‭ ‬دلیل‭ ‬کمبود‭ ‬بودجه‭ ‬و‭ ‬مشکلات‭ ‬محیط‭ ‬آزمایشگاهی‭ ‬در‭ ‬آلیکانته،‭ ‬پژوهش‌های‭ ‬خود‭ ‬را‭ ‬معطوف‭ ‬به‭ ‬بیوانفورماتیک‭ ‬و‭ ‬بررسی‭ ‬توالی‌های‭ ‬ناشناس‭ ‬کرده‭ ‬و‭ ‬نام‭ ‬آن‌را‭ ‬‮«‬تکرار‌های‭ ‬کوتاه‭ ‬با‭ ‬فاصله‌های‭ ‬منظم‮»‬‭ ‬یا‭ ‬SRSR‭ ‬گذاشت. نام‭ ‬این‭ ‬توالی‌ها‭ ‬بعداً‭ ‬به‭ ‬تکرا‌ر‌های‭ ‬پالیندروم‭ ‬کوتاه‭ ‬با‭ ‬فاصله‌های‭ ‬منظم‭ ‬یا‭ ‬به‭ ‬اختصار‭ ‬CRISPR‭ ‬تغییر‭ ‬یافت. تا‭ ‬سال‭ ‬۲۰۰۰‭ ‬موجیکا‭ ‬موفق‭ ‬به‭ ‬کشف‭ ‬لوکوس‌های‭ ‬کریسپر‭ ‬در‭ ‬۲۰‭ ‬میکروب‭ ‬مختلف‭ ‬از‭ ‬جمله‭ ‬باکتری‭ ‬عامل‭ ‬طاعون‭ ‬و‭ ‬سل‭ ‬شد. دو‭ ‬سال‭ ‬پس‭ ‬از‭ ‬این‭ ‬اکتشافات‭ ‬سایر‭ ‬دانشمندان‭ ‬موفق‭ ‬به‭ ‬کشف‭ ‬ژن‌های‭ ‬مرتبط‭ ‬با‭ ‬کریسپر‭ (‬CRISPR associated genes‭) ‬یا‭ ‬cas‭ ‬در‭ ‬مناطق‭ ‬اطراف‭ ‬آن‭ ‬شدند‭.‬

اما‭ ‬سؤال‭ ‬اساسی‭ ‬این‭ ‬بود‭ ‬که‭ ‬کاربرد‭ ‬کریسپر‭ ‬چیست؟‭ ‬گمان‌های‭ ‬فراوانی‭ ‬در‭ ‬آن‭ ‬زمان‭ ‬مطرح‭ ‬می‌شد. از‭ ‬جمله‌ی‭ ‬آن‌ها‭ ‬کاربرد‭ ‬در‭ ‬تنظیم‭ ‬بیان‭ ‬ژن‭ ‬و‭ ‬تعمیر‭ ‬DNA‭ ‬بود. اما‭ ‬نادرستی‭ ‬تک‌تک‭ ‬ادعا‌های‭ ‬مطرح‭ ‬شده‭ ‬در‭ ‬زمان‭ ‬کوتاهی‭ ‬اثبات‭ ‬می‌شد‭.‬

کریسپر،‭ ‬یک‭ ‬سیستم‭ ‬ایمنی‭ ‬ذاتی‭ ‬است

موجیکا‭ ‬در‭ ‬سال‭ ‬۲۰۰۳‭ ‬پژوهش‭ ‬خود‭ ‬را‭ ‬به‌جای‭ ‬بررسی‭ ‬توالی‌های‭ ‬حفظ‭ ‬شده،‭ ‬بر‭ ‬روی‭ ‬توالی‌های‭ ‬فاصله‌انداز‭ ‬میان‭ ‬آن‌ها‭ ‬معطوف‭ ‬کرد. او‭ ‬با‭ ‬کمک‭ ‬برنامه‌ی‭ ‬BLAST‭ ‬که‭ ‬شباهت‭ ‬توالی‌های‭ ‬DNA‭ ‬را‭ ‬مورد‭ ‬بررسی‭ ‬قرار‭ ‬می‌دهد،‭ ‬به‭ ‬مقایسه‌ی‭ ‬توالی‌های‭ ‬فاصله‌انداز‭ ‬پرداخت. در‭ ‬یافته‌ای‭ ‬تاریخی،‭ ‬یکی‭ ‬از‭ ‬لوکوس‌های‭ ‬کریسپر‭ ‬در‭ ‬باکتری‭ ‬E.Coli‭ ‬مورد‭ ‬بررسی،‭ ‬با‭ ‬توالی‭ ‬باکتریوفاژ‭ ‬P1‭ ‬که‭ ‬اکثر‭ ‬سویه‌های‭ ‬E.Coli‭ ‬را‭ ‬آلوده‭ ‬می‌کند‭ ‬مطابقت‭ ‬داشت‭.‬

همچنین‭ ‬سویه‌ای‭ ‬که‭ ‬موجیکا‭ ‬موفق‭ ‬یه‭ ‬یافتن‭ ‬توالی‭ ‬فاصله‌اندازه‭ ‬مشابه‭ ‬با‭ ‬فاژ‭ ‬P1‭ ‬شده‭ ‬بود،‭ ‬به‭ ‬این‭ ‬ویروس‭ ‬مقاومت‭ ‬نشان‭ ‬می‌داد‭.‬

وی‭ ‬پس‭ ‬از‭ ‬کشف‭ ‬این‭ ‬مورد‭ ‬به‭ ‬بررسی‭ ‬۴۵۰۰‭ ‬توالی‭ ‬فاصله‌انداز‭ ‬دیگر‭ ‬پرداخت. نتایج‭ ‬نشان‭ ‬می‌داد،‭ ‬دو‭ ‬سوم‭ ‬از‭ ‬۸۸‭ ‬توالی‭ ‬فاصله‌اندازی‭ ‬که‭ ‬موردی‭ ‬مشابه‭ ‬از‭ ‬آن‭ ‬در‭ ‬بانک‭ ‬اطلاعاتی‭ ‬ثبت‭ ‬شده‭ ‬بود،‭ ‬مربوط‭ ‬به‭ ‬ژنوم‭ ‬ویروس‌ها‭ ‬و‭ ‬یا‭ ‬پلازمید‌های‭ ‬کونژوگه‭ ‬است. این‭ ‬نتایج‭ ‬سبب‭ ‬شد‭ ‬تا‭ ‬موجیکا‭ ‬عملکرد‭ ‬این‭ ‬سری‭ ‬از‭ ‬تناوب‌ها‭ ‬را‭ ‬به‭ ‬عنوان‭ ‬سیستم‭ ‬ایمنی‭ ‬ذاتی‭ ‬باکتری‌ها‭ ‬در‭ ‬نظر‭ ‬گیرد‭.‬

در‭ ‬مدتی‭ ‬کوتاه‭ ‬موجیکا‭ ‬مقاله‌ای‭ ‬تدارک‭ ‬دید‭ ‬و‭ ‬با‭ ‬توجه‭ ‬به‭ ‬اهمیت‭ ‬فراوان‭ ‬آن‭ ‬به‭ ‬ژورنال‭ ‬Nature‭ ‬ارسال‭ ‬نمود. در‭ ‬نوامبر‭ ‬۲۰۰۳‭‬، ژورنال‭ ‬مذکور‭ ‬بدون‭ ‬درخواست‭ ‬هیچ‌گونه‭ ‬بازبینی‌ای‭ ‬مقاله‭ ‬را‭ ‬به‭ ‬علت‭ ‬تکراری‭ ‬بودن‭ ‬ایده‌ی‭ ‬اصلی‭ ‬رد‭ ‬کرد. سپس‭ ‬موجیکا‭ ‬اقدام‭ ‬به‭ ‬ارسال‭ ‬مقاله‭ ‬به‭ ‬مجلات‭ ‬دیگر‭ ‬نمود. در‭ ‬پایان،‭ ‬پس‭ ‬از‭ ‬چندین‭ ‬بار‭ ‬رد‭ ‬مقاله،‭ ‬وی‭ ‬توانست‭ ‬یافته‌های‭ ‬خود‭ ‬را‭ ‬در‭ ‬ژورنال ‭ ‬Molecular Evolution‭‬بعد‭ ‬از‭ ‬۱۲‭ ‬ماه‭ ‬بازبینی،‭ ‬با‭ ‬عنوان‭ ‬‮«‬عملکرد‭ ‬احتمالی‭ ‬کریسپرها‮»‬‭ ‬منتشر‭ ‬کند‭.‬

برنامه‌ریزی‭ ‬کریسپر

جان‭ ‬ون‭ ‬در‭ ‬اوست‭ (‬John van der Oost‭) ‬مدرک‭ ‬دکترای‭ ‬خود‭ ‬را‭ ‬از‭ ‬دانشگاه‭ ‬آمستردام‭ ‬دریافت‭ ‬کرد. اوست‭ ‬در‭ ‬سال‭ ‬۲۰۰۵‭ ‬با‭ ‬بودجه‌ی‭ ‬تحقیقاتی‭ ‬خود‭ ‬به‭ ‬کمک‭ ‬یوگن‭ ‬کونین‭ (‬Eugene Koonin‭) ‬به‭ ‬بررسی‭ ‬باکتری‌های‭ ‬سختی‭ ‬دوست‭ ‬پرداخته‭ ‬و‭ ‬بخشی‭ ‬از‭ ‬آن‭ ‬را‭ ‬صرف‭ ‬آنالیز‭ ‬توالی‌های‭ ‬کریسپر‭ ‬کرد‭.‬

او‭ ‬و‭ ‬همکارانش،‭ ‬کریسپرِ‭ ‬سویه‌ای‭ ‬از‭ ‬E.Coli‭ ‬را‭ ‬به‭ ‬سویه‌ای‭ ‬دیگر‭ ‬از‭ ‬این‭ ‬باکتری‭ ‬که‭ ‬فاقد‭ ‬آن‭ ‬بود،‭ ‬منتقل‭ ‬کردند. این‭ ‬فرآیند‭ ‬به‭ ‬پژوهشگران‭ ‬اجازه‭ ‬می‌داد‭ ‬تا‭ ‬مجموعه‌ی‭ ‬پنج‭ ‬پروتئین‭ ‬Cas‭ ‬را‭ ‬از‭ ‬منظر‭ ‬بیومدیکال‭ ‬مشخص‭ ‬نمایند. اعضای‭ ‬گروه‭ ‬اوست‭ ‬با‭ ‬حذف‭ ‬هر‭ ‬جزء،‭ ‬نشان‭ ‬دادند‭ ‬Casها‭ ‬برای‭ ‬برش‭ ‬پیش‌ساز‭ ‬RNA‭ ‬رونویسی‭ ‬شده‭ ‬از‭ ‬ژن‭ ‬کریسپر‭ ‬به‭ ‬RNA‭ ‬۶۱‭ ‬نوکلئوتیدی‭ ‬نهایی ‭ ،(‬crRNA‭)‬‬لازم‌اند‭.‬

به‌منظور‭ ‬اثبات‭ ‬عملکرد‭ ‬crRNA‭ ‬در‭ ‬مقاومت‭ ‬باکتریایی‭ ‬وابسته‭ ‬به‭ ‬کریسپر،‭ ‬تیم‭ ‬اوست‭ ‬اقدام‭ ‬به‭ ‬ساخت‭ ‬اولین‭ ‬آرایه‌ی‭ ‬کریسپر‭ ‬مصنوعی‭ ‬کرد. این‭ ‬عملکرد‭ ‬موجب‭ ‬برنامه‌ریزی‭ ‬کریسپر‭ ‬جهت‭ ‬هدف‌گیری‭ ‬چهار‭ ‬ژن‭ ‬اساسی‭ ‬در‭ ‬فاژ‭ ‬لامبدا‭ ‬می‌شد. مطابق‭ ‬با‭ ‬فرضیه‌ی‭ ‬مطرح‭ ‬شده‭ ‬سویه‌هایی‭ ‬که‭ ‬توالی‭ ‬جدید‭ ‬کریسپر‭ ‬را‭ ‬حمل‭ ‬می‌کردند،‭ ‬به‭ ‬فاژ‭ ‬لامبدا‭ ‬مقاومت‭ ‬نشان‭ ‬می‌دادند. این‭ ‬آزمایش‭ ‬نخستین‭ ‬ایمنی‭ ‬ایجاد‭ ‬شده‭ ‬به‭ ‬کمک‭ ‬کریسپر‭ ‬در‭ ‬تاریخ‭ ‬علم‭ ‬بود‭.‬

نتایج‭ ‬بررسی‌ها‭ ‬همچنین‭ ‬نشان‭ ‬داد‭ ‬که‭ ‬توالی‭ ‬هدف‭ ‬سیستم‭ ‬کریسپر‭ ‬مولکول‭ ‬RNA‭ ‬نبوده‭ ‬و‭ ‬مستقیماً‭ ‬بر‭ ‬روی‭ ‬DNA‭ ‬اثر‭ ‬می‌گذارد. این‭ ‬گروه‭ ‬همچنین‭ ‬برای‭ ‬اثبات‭ ‬آن‌که‭ ‬مولکول‭ ‬DNA،‭ ‬هدف‭ ‬توالی‌های‭ ‬کریسپر‭ ‬است،‭ ‬از‭ ‬دو‭ ‬سری‭ ‬آرایه‭ ‬استفاده‭ ‬نمود. یکی‭ ‬از‭ ‬توالی‌ها،‭ ‬مکمل‭ ‬mRNA‭ ‬و‭ ‬رشته‌ی‭ ‬کدکننده‭ ‬بود‭ ‬و‭ ‬دیگری،‭ ‬مکمل‭ ‬رشته‌ی‭ ‬دیگر ‭‬DNA. با‭ ‬وجود‭ ‬تمامی‭ ‬تلاش‌های‭ ‬شکل‭ ‬گرفته،‭ ‬ویراستاران‭ ‬ژورنال‭ ‬Science‭ ‬پس‭ ‬از‭ ‬ارسال‭ ‬مقاله‭ ‬توسط‭ ‬اوست،‌‭ ‬تأکید‭ ‬ویژه‌ای‭ ‬بر‭ ‬عدم‭ ‬قطعیت‭ ‬این‭ ‬موضوع‭ ‬داشته‭ ‬و‭ ‬آن‌‭ ‬را‭ ‬تحت‭ ‬عنوان‭ ‬فرضیه‭ ‬منتشر‭ ‬ساختند‭.‬

کریسپر‭ ‬DNA‭ ‬را‭ ‬هدف‭ ‬قرار‭ ‬می‌دهد

لوسیانو‭ ‬مارافینی‭ (‬Luciano Marraffini‭) ‬همزمان‭ ‬با‭ ‬اتمام‭ ‬دوره‌ی‭ ‬دکتری‭ ‬در‭ ‬دانشگاه‭ ‬شیکاگو‭ ‬بر‭ ‬روی‭ ‬استافیلوکوکوس‭ ‬کار‭ ‬می‌کرد. پس‭ ‬از‭ ‬همکاری‭ ‬با‭ ‬دکتر‭ ‬کازادابان‭ (‬Casadaban‭) ‬و‭ ‬درک‭ ‬اهمیت‭ ‬کریسپر‭ ‬در‭ ‬مکانیسم‭ ‬ایمنی‭ ‬باکتریایی،‭ ‬همکاری‭ ‬ویژه‌ای‭ ‬جهت‭ ‬اثبات‭ ‬فعالیت‭ ‬محصولات‭ ‬کریسپر‭ ‬روی‭ ‬رشته‌ی‭ ‬DNA‭ ‬صورت‭ ‬گرفت. علت‭ ‬اصلی‭ ‬موضوع‭ ‬آن‭ ‬بود‭ ‬که‭ ‬کازادابان‭ ‬اعتقاد‭ ‬داشت‭ ‬با‭ ‬توجه‭ ‬به‭ ‬حجم‭ ‬عظیمی‭ ‬از‭ ‬محصولات‭ ‬RNA‭ ‬ویروسیِ‭ ‬تولید‭ ‬شده‭ ‬حین‭ ‬حمله‭ ‬ویروس،‭ ‬منطقی‭ ‬نیست‭ ‬که‭ ‬کریسپر‭ ‬با‭ ‬مکانیسم‭ ‬تداخل‭ ‬با ‭ ‬RNA‌های‭ ‬ویروسی‭ ‬فعالیت‭ ‬کند‭.‬

مارافینی‭ ‬در‭ ‬بررسی‌های‭ ‬مرتبط‭ ‬با‭ ‬استافیلوکوکوس،‭ ‬متوجه‭ ‬شد‭ ‬سویه‌ای‭ ‬از‭ ‬استافیلوکوکوس‭ ‬اپیدرمیس‭ ‬دارای‭ ‬توالی‭ ‬فاصله‌اندازی‭ ‬در‭ ‬کریسپر‭ ‬خود‭ ‬است‭ ‬که‭ ‬با‭ ‬توالی‭ ‬خاصی‭ ‬از‭ ‬پلازمید‭ ‬ضدآنتی‌بیوتیکی‭ (‬ژن‭ ‬nes‭) ‬استافیلوکوکوس‭ ‬اورئوس‭ ‬مطابقت‭ ‬دارد. بررسی‌های‭ ‬بعدی‭ ‬نشان‭ ‬داد‭ ‬امکان‭ ‬انتقال‭ ‬این‭ ‬پلازمید‭ ‬به‭ ‬سویه‌ی‭ ‬ذکر‭ ‬شده‌ی‭ ‬استافیلوکوکوس‭ ‬اپیدرمیس‭ ‬وجود‭ ‬ندارد. به‌طور‭ ‬واضح‭ ‬کریسپر‭ ‬استافیلوکوکوس‭ ‬اپیدرمیس‭ ‬موجب‭ ‬بلوکه‭ ‬شدن‭ ‬پلازمید‭ ‬باکتری‭ ‬دیگر‭ ‬شده‭ ‬بود؛‭ ‬دقیقاً‭ ‬همان‌طور‭ ‬که‭ ‬موجب‭ ‬مهار‭ ‬ویروس‭ ‬می‌شد‭.‬

پس‭ ‬از‭ ‬این‭ ‬یافته‌ی‭ ‬فوق‌العاده،‭ ‬مارافینی‭ ‬به‭ ‬کمک‭ ‬همکار‭ ‬خود‭ ‬دکتر‭ ‬سانتیمر‭ (‬Sontheimer‭) ‬به‭ ‬فکر‭ ‬بازسازی‭ ‬سیستم‭ ‬کریسپر‭ ‬در‭ ‬محیط‭ ‬آزمایشگاهی‭ – ‬جهت‭ ‬اثبات‭ ‬کارایی‭ ‬آن‭ ‬در‭ ‬برش‭ ‬DNA‭ – ‬افتاد. اما‭ ‬سیستم‭ ‬استافیلوکوکوس‭ ‬اپیدرمیس‭ ‬بسیار‭ ‬پیچیده‭ ‬بوده‭ ‬و‭ ‬دارای‭ ‬۹‭ ‬ژن‭ ‬cas‭ ‬است. در‭ ‬اقدامی‭ ‬بسیار‭ ‬هوشمندانه،‭ ‬آن‌ها‭ ‬ژن‭ ‬nes‭ ‬که‭ ‬بر‭ ‬روی‭ ‬پلازمید‭ ‬استافیلوکوکوس‭ ‬اورئوس‭ ‬بود‭ ‬را‭ ‬به‭ ‬کمک‭ ‬اضافه‭ ‬نمودن‭ ‬یک‭ ‬اینترون‭ ‬که‭ ‬به‌صورت‭ ‬خودکار‭ ‬قابلیت‭ ‬برش‭ ‬خود‭ ‬را‭ ‬دارد‭ ‬تغییر‭ ‬دادند؛‭ ‬این‭ ‬اینترون‭ ‬در‭ ‬میانه‌ی‭ ‬توالی‭ ‬فاصله‌انداز‭ ‬قرار‭ ‬داشت. در‭ ‬صورتی‭ ‬که‭ ‬مکانیسم‭ ‬عملکرد‭ ‬کریسپر،‭ ‬تداخل ‭ ‬RNA‭ ‬می‌بود،‭ ‬می‌بایستی‭ ‬هیچ‌گونه‭ ‬تغییری‭ ‬در‭ ‬قبول‭ ‬و‭ ‬یا‭ ‬رد‭ ‬پلازمید‭ ‬جدید‭ ‬رخ‭ ‬نمی‌داد. اما‭ ‬با‭ ‬توجه‭ ‬به‭ ‬تغییر‭ ‬توالی‭ ‬DNA‭ ‬در‭ ‬بخش‭ ‬فاصله‌انداز،‭ ‬در‭ ‬صورتی‭ ‬که‭ ‬مکانیسم‭ ‬عمل‭ ‬کریسپر‭ ‬برش‭ ‬DNA‭ ‬می‌بود،‭ ‬می‌بایستی‭ ‬مکانیسم‭ ‬بلوکه‭ ‬شدن‭ ‬دیگر‭ ‬رخ‭ ‬نمی‌داد. نتایج‭ ‬فوق‌العاده‭ ‬بود؛‭ ‬هیچ‌گونه‭ ‬تداخلی‭ ‬رخ‭ ‬نداد‭:‬ کریسپر‭ ‬بر‭ ‬روی‭ ‬DNA‭ ‬عمل‭ ‬می‌کرد‭!‬

نتایج‭ ‬مطالعات‭ ‬مارافینی‭ ‬و‭ ‬سانتیمر‭ ‬نشان‭ ‬می‌داد،‭ ‬کریسپر‭ ‬سیستمی‭ ‬قابل‭ ‬برنامه‌ریزی‭ ‬متشکل‭ ‬از‭ ‬آنزیم‌های‭ ‬محدود‌کننده‭ ‬است. در‭ ‬مقاله‭ ‬منتشر‭ ‬شده‭ ‬از‭ ‬آن‌ها،‭ ‬به‌طور‭ ‬واضحی‭ ‬به‭ ‬پتانسیل‭ ‬این‭ ‬سیستم‭ ‬در‭ ‬اصلاح‭ ‬ژنتیک‭ ‬اشاره‭ ‬شده‭ ‬بود. در‭ ‬کنار‭ ‬انتشار‭ ‬یافته‌ها،‭ ‬این‭ ‬دو‭ ‬دانشمند‭ ‬اقدام‭ ‬به‭ ‬ثبت‭ ‬پتنت‭ ‬استفاده‭ ‬از‭ ‬این‭ ‬سیستم‭ ‬در‭ ‬برش‭ ‬یا‭ ‬تصحیح‭ ‬لوکوس‌های‭ ‬ژنیِ‭ ‬سلول‌های‭ ‬یوکاریوتی‭ ‬کردند؛‭ ‬اما‭ ‬به‌دلیل‭ ‬کمبود‭ ‬یافته‌های‭ ‬تجربی‭ ‬در‭ ‬این‭ ‬رابطه،‭ ‬تلاش‭ ‬آن‌ها‭ ‬در‭ ‬ثبت‭ ‬پتنت‭ ‬با‭ ‬موفقیت‭ ‬همراه‭ ‬نبود‭.‬

کمپلکس‭ ‬Cas9‭ ‬به‭ ‬وسیله‌ی‭ ‬crRNA‭ ‬راهنمایی‭ ‬شده‭ ‬و‭ ‬سبب‭ ‬برش‭ ‬دو‭ ‬رشته‌ی‭ ‬DNA‭ ‬می‌شود‭ ‬در‭ ‬پی‭ ‬مطالعه‌ی‭ ‬صورت‭ ‬گرفته‭ ‬در‭ ‬سال‭ ‬۲۰۰۷‭ ‬که‭ ‬کریسپر‭ ‬را‭ ‬به‭ ‬عنوان‭ ‬سیستم‭ ‬ایمنی‭ ‬ذاتی‭ ‬معرفی‭ ‬کرده‭ ‬بود،‭ ‬سیلوین‭ ‬موئینیو با‭ ‬بررسی‭ ‬نقاط‭ ‬برش‭ ‬ژنوم‭ ‬ویروسی‭ ‬دریافت،‭ ‬تعداد‭ ‬برش‌های‭ ‬ایجاد‭ ‬شده،‭ ‬برابر‭ ‬با‭ ‬تعداد‭ ‬توالی‌های‭ ‬مطابق‭ ‬کریسپر‭ ‬و‭ ‬ژنوم‭ ‬ویروسی‭ ‬است. همچنین‭ ‬با‭ ‬بررسی‭ ‬توالی‌های‭ ‬برش‌یافته،‭ ‬تطابق‭ ‬دقیق‭ ‬آن‌ها‭ ‬با‭ ‬توالی‭ ‬crRNA‭ ‬مشخص‭ ‬شد. لازم‭ ‬به‭ ‬ذکر‭ ‬است‭ ‬که‭ ‬این‭ ‬فرآیند‭ ‬به‭ ‬کمک‭ ‬آنزیم‌های‭ ‬Cas9‭ ‬صورت‭ ‬می‌گیرد‭.‬

کشف tracrRNA

با وجود مطالعات فراوان صورت گرفته بر روی سیستم CRISPR-Cas9، یک تکه‌ی دیگر پازل باقی‌مانده بود. این تکه، قطعه‌ای کوچک به نام trans-activating CRISPR RNA یا tracrRNA بود که با کوشش امانوئل کارپنتیر (Emmanuelle Charpentier) به‌طور اتفاقی کشف شد.

ویرایش‭ ‬ژنوم‭ ‬سلول‌های‭ ‬پستانداران

در‭ ‬سال‭ ‬۱۹۸۰‭ ‬دانشمندان‭ ‬موفق‭ ‬به‭ ‬یافتن‭ ‬راهی‭ ‬برای‭ ‬تغییر‭ ‬ژنوم‭ ‬سلول‌های‭ ‬پستانداران‭ ‬زنده‭ ‬و‭ ‬الصاق‭ ‬DNA‭ ‬به‭ ‬نقاطی‭ ‬خاص‭ ‬در‭ ‬رویان‭ ‬موش‭ ‬شدند. اما‭ ‬این‭ ‬فرآیند‭ ‬بهینه‭ ‬نبوده‭ ‬و‭ ‬تنها‭ ‬یک‭ ‬مورد‭ ‬از‭ ‬هزاران‭ ‬سلول‭ ‬دستکاری‭ ‬شده‭ ‬نتایج‭ ‬دلخواه‭ ‬را‭ ‬نشان‭ ‬می‌داد‭.‬

سوالات‭ ‬زیادی‭ ‬بر‭ ‬اساس‭ ‬ادعای‭ ‬مطرح‭ ‬شده‭ ‬در‭ ‬سال‭ ‬۲۰۰۸‭ ‬توسط‭ ‬مارافینی‭ ‬و‭ ‬سانتیمر‭ ‬مبنی‭ ‬بر‭ ‬پتانسیل‭ ‬سیستم‭ ‬کریسپر‭ ‬در‭ ‬اصلاح‭ ‬ژنتیکی‭ ‬مطرح‭ ‬شد. مشکلات‭ ‬زیادی‭ ‬در‭ ‬مسیر‭ ‬استفاده‭ ‬از‭ ‬این‭ ‬سیستم‭ ‬در‭ ‬ویرایش‭ ‬ژن‭ ‬یوکاریوتی‭ ‬وجود‭ ‬داشت. از‭ ‬جمله‌ی‭ ‬این‭ ‬موارد،‭ ‬ژنوم‭ ‬بسیار‭ ‬پیچیده‭ ‬و‭ ‬بزرگ‌تر‭ ‬یوکاریوتی،‭ ‬حضور‭ ‬ساختا‌ر‌های‭ ‬کروماتینی‭ ‬ویژه‭ ‬یوکاریوتی‭ ‬و‭ ‬محیط‭ ‬داخل‭ ‬سلولی‭ ‬متفاوت‭ ‬بود. همچنین‭ ‬تلاش‌های‭ ‬صورت‭ ‬گرفته‭ ‬برای‭ ‬انتقال‭ ‬سیستم‌های‭ ‬باکتریاییِ‭ ‬ساده‌‭ – ‬مانند‭ ‬اینترون‌هایی‭ ‬با‭ ‬پیرایش‭ ‬خودکار‭ – ‬نیز‭ ‬با‭ ‬موفقیت‭ ‬همراه‭ ‬نبود. تمامی‭ ‬این‭ ‬موارد‭ ‬سوالات‭ ‬زیادی‭ ‬را‭ ‬در‭ ‬ارتباط‭ ‬با‭ ‬توانایی‭ ‬کریسپر‭ ‬در‭ ‬هدف‌گیری‭ ‬ژنوم‭ ‬یوکاریوتی‭ ‬به‭ ‬پیش‭ ‬کشیده‭ ‬بود‭.‬

فنگ‭ ‬ژنگ‭ (‬Feng Zhang‭) ‬در‭ ‬۱۶‭ ‬سالگی،‭ ‬بیست‭ ‬ساعت‭ ‬از‭ ‬زمان‭ ‬هفتگی‭ ‬خود‭ ‬را‭ ‬در‭ ‬آزمایشگاه‭ ‬اصلاح‭ ‬ژن‭ ‬می‌گذراند. حوزه‌ی‭ ‬علاقه‌مندی‭ ‬وی‭ ‬اپتوژنتیک‭ (‬Optogenetic‭) – ‬تکنیکی‭ ‬انقلابی‭ ‬که‭ ‬فعالیت‭ ‬نورون‌ها‭ ‬را‭ ‬حین‭ ‬ارسال‭ ‬ایمپالس‌های‭ ‬عصبی‭ ‬به‭ ‬کمک‭ ‬نور‭ ‬نشان‭ ‬می‌دهد‭ – ‬است. او‭ ‬پس‭ ‬از‭ ‬توسعه‌ی‭ ‬راهی‭ ‬برای‭ ‬ردیابی‭ ‬بیان‭ ‬ژن‭ ‬به‭ ‬کمک‭ ‬نور،‭ ‬به‭ ‬برنامه‌ریزی‭ ‬فاکتور‌های‭ ‬رونویسی‭ ‬علاقه‭ ‬نشان‭ ‬داد‭.‬

ژنگ‭ ‬توانست‭ ‬با‭ ‬تلاش‭ ‬فراوان‭ ‬خود‭ ‬نسخه‌ی‭ ‬ویژه‌ای‭ ‬از‭ ‬Cas9‭ ‬باکتری‭ ‬استافیلوکوکوس‭ ‬ترموفیلوس‭ ‬را‭ ‬برای‭ ‬استفاده‭ ‬در‭ ‬سلول‌های‭ ‬انسانی‭ ‬طراحی‭ ‬کند. در‭ ‬آوریل‭ ‬۲۰۱۱،‭ ‬وی‭ ‬موفق‭ ‬شد‭ ‬به‌کمک‭ ‬بیان‭ ‬Cas9‭ ‬و‭ ‬CRISPR RNA‭ ‬مهندسی‌شده‌ای‭ ‬که‭ ‬ژن‭ ‬لوسیفراز‭ ‬را‭ ‬در‭ ‬پلازمید‭ ‬هدف‭ ‬قرار‭ ‬می‌دهد،‭ ‬میزان‭ ‬بیان‭ ‬این‭ ‬ژن‭ ‬را‭ ‬در‭ ‬سلول‌های‭ ‬رویانی‭ ‬کلیه‭ ‬انسان‭ ‬کاهش‭ ‬دهد. با‭ ‬این‭ ‬حال‭ ‬تأثیر‭ ‬این‭ ‬فرآیند‭ ‬چشمگیر‭ ‬نبود. ژنگ‭ ‬یک‭ ‬سال‭ ‬را‭ ‬صرف‭ ‬بهینه‌کردن‭ ‬سیستم‭ ‬طراحی‭ ‬شده‌ی‭ ‬خود‭ ‬کرد‭ .‬در‭ ‬میانه‌ی‭ ‬۲۰۱۲‭ ‬وی‭ ‬توانسته‭ ‬بود‭ ‬سیستم‭ ‬سه‭-‬بخشی‭ ‬خود‭ ‬را‭ ‬که‭ ‬شامل‭ ‬Cas9‭ ‬استروپتوکوکوس‭ ‬پایوژن‭ ‬و‭ ‬یا‭ ‬استافیلوکوکوس‭ ‬ترموفیلوس،‭ ‬tracrRNA‭ ‬و‭ ‬آرایه‌ی‭ ‬کریسپر‭ ‬بود‭ ‬طراحی‭ ‬کند. او‭ ‬با‭ ‬هدف‌گیری‭ ‬۱۶‭ ‬ناحیه‭ ‬در‭ ‬ژنوم‭ ‬انسان‭ ‬و‭ ‬موش،‭ ‬نشان‭ ‬داد‭ ‬که‭ ‬می‌توان‭ ‬به‭ ‬کمک‭ ‬این‭ ‬سیستم‭ ‬ژن‌های‭ ‬انسانی‭ ‬را‭ ‬با‭ ‬بهینگی‭ ‬بالا‭ ‬تغییر‭ ‬داد. ژنگ‭ ‬و‭ ‬کونین‭ ‬مدتی‭ ‬کوتاه‭ ‬پس‭ ‬از‭ ‬یافته‌های‭ ‬ذکر‭ ‬شده‭ ‬موفق‭ ‬به‭ ‬کشف‭ ‬کلاس‭ ‬دیگری‭ ‬از‭ ‬سیستم‭ ‬کریسپر‭ ‬شدند.

در‭ ‬کلاس‭ ‬دو‭ ‬سیستم‭ ‬کریسپر‭ ‬عملکرد‭ ‬برش‭ ‬توالی‭ ‬DNA‭ ‬وابسته‭ ‬به‭ ‬tracrRNA‭ ‬نبوده‭ ‬و‭ ‬تنها‭ ‬با‭ ‬کمک‭ ‬crRNA‭ ‬صورت‭ ‬می‌پذیرد. ژنگ‭ ‬به‭ ‬کمک‭ ‬همکاران‭ ‬خود‭ ‬در‭ ‬ژانویه‭ ‬،۲۰۱۳‭ ‬مقاله‌ای‭ ‬در‭ ‬ارتباط‭ ‬با‭ ‬ویرایش‭ ‬ژنوم‭ ‬پستانداران‭ ‬منتشر‭ ‬نمود. این‭ ‬مقاله‭ ‬که‭ ‬در‭ ‬ژورنال‭ ‬Science‭ ‬منتشر‭ ‬شده،‭ ‬بالاترین‭ ‬میزان‭ ‬ارجاعات‭ ‬را‭ ‬در‭ ‬این‭ ‬حوزه‭ ‬به‭ ‬خود‭ ‬اختصاص‭ ‬داده‭ ‬است. از‭ ‬اوایل‭ ‬سال‭ ‬۲۰۱۳‭ ‬روند‭ ‬جستجوی‭ ‬عبارت‭ ‬کریسپر‭ ‬در‭ ‬گوگل‭ ‬با‭ ‬افزایشی‭ ‬بسیار‭ ‬چشمگیر‭ ‬همراه‭ ‬بوده‭ ‬و‭ ‬این‭ ‬روند‭ ‬در‭ ‬حال‭ ‬حاضر‭ ‬نیز‭ ‬ادامه‭ ‬دارد. حدود‭ ‬یک‭ ‬ماه‭ ‬بعد‭ ‬در‭ ‬۲۶‭ ‬اکتبر،‭ ‬جرج‭ ‬چرچ‭ ‬پروفسور‭ ‬دانشگاه‭ ‬هاروارد‭ ‬که‭ ‬حوزه‌ی‭ ‬تخصصی‭ ‬وی‭ ‬ژنومیک‭ ‬و‭ ‬زیست‌شناسی‭ ‬سنتتیک‭ ‬است،‭ ‬با‭ ‬همکاری‭ ‬ژنگ‭ ‬مقاله‌ای‭ ‬تحت‭ ‬عنوان‭ ‬ویرایش‭ ‬ژنوم‭ ‬انسانی‭ ‬منتشر‭ ‬ساختند‭ ‬و‭ ‬با‭ ‬تأثیر‭ ‬مقاله‌ی‭ ‬شارپندیر‭ ‬و‭ ‬جنیفر‭ ‬دودنا،‭ ‬چرچ‭ ‬اقدام‭ ‬به‭ ‬آزمایش‭ ‬تلفیق‭ ‬crRNA-tracrRNA‭ ‬در‭ ‬سلول‌های‭ ‬پستانداران‭ ‬کرد.

ویرایش‭ ‬باز

پنج‭ ‬سال‭ ‬از‭ ‬شروع‭ ‬با‭ ‬اشتیاق‭ ‬تحقیقات‭ ‬روی‭ ‬کریسپر‭ ‬می‌گذرد‭ ‬و‭ ‬دانشمندان‭ ‬به‭ ‬نسخه‌های‭ ‬تطابق‌پذیر،‭ ‬مؤثر‭ ‬و‭ ‬قدرتمندتر‭ ‬این‭ ‬ابزار‭ ‬دست‭ ‬یافته‌اند‭ ‬که‭ ‬به‭ ‬طور‭ ‬گسترده‌ای‭ ‬ویرایش‭ ‬DNA‭ ‬را‭ ‬تسهیل‭ ‬می‌نماید. دو‭ ‬مطالعه‭ ‬که‭ ‬به‭ ‬تازگی‭ ‬در‭ ‬Science‭ ‬و‭ ‬Nature‭‬ منتشر‭ ‬شده‭ ‬است،‭ ‬دسترسی‭ ‬کریسپر‭ ‬را‭ ‬برای‭ ‬تغییر‭ ‬ماده‌ی‭ ‬ژنتیک‭ ‬از‭ ‬این‭ ‬هم‭ ‬گسترده‌تر‭ ‬و‭ ‬البته‭ ‬ظریف‌تر‭ ‬می‌کند؛‭ ‬روشی‭ ‬که‭ ‬ویرایش‭ ‬باز‭ ‬نام‭ ‬گرفته‭ ‬است. یکی‭ ‬از‭ ‬مطالعات،‭ ‬استراتژی‌ای‭ ‬را‭ ‬برای‭ ‬ویرایش‭ ‬DNA‭ ‬و‭ ‬دیگری‭ ‬برایRNA‭ ‬ پیشنهاد‭ ‬داده‭ ‬است‭.‬ هر‭ ‬دو‭ ‬پژوهش‭ ‬صورت‭ ‬گرفته‭ ‬راه‌های‭ ‬جدیدی‭ ‬را‭ ‬برای‭ ‬مطالعات‭ ‬ژنتیکی‭ ‬و‭ ‬حتی‭ ‬درمان‭ ‬بیماری‌ها‭ ‬ایجاد‭ ‬کرده‌اند. دیوید‭ ‬لیو،‭ ‬شیمی‌دان‭ ‬دانشگاه‭ ‬هاروارد‭ ‬که‭ ‬پیشگام‭ ‬ویرایش‭ ‬باز‭ ‬در‭ ‬هر‭ ‬دو‭ ‬بخش‭ ‬DNA‭ ‬و‭ ‬RNA‭ ‬است،‭ ‬می‌گوید‭:‬

کسی‭ ‬نباید‭ ‬این‭ ‬فکر‭ ‬را‭ ‬بکند‭ ‬که‭ ‬ویرایشگرهای‭ ‬باز‭ ‬بهتر‭ ‬از‭ ‬کریسپر‭ ‬اند؛‭ ‬آن‌ها‭ ‬فقط‭ ‬متفاوت‌اند. مثل‭ ‬این‭ ‬می‌ماند‭ ‬که‭ ‬بپرسید‭ ‬کدامیک‭ ‬بهتر‭ ‬است،‭ ‬قایق‭ ‬یا‭ ‬خودرو؟

کریسپر‭ ‬که‭ ‬از‭ ‬سیستم‭ ‬دفاعی‭ ‬باکتریایی‭ ‬گرفته‭ ‬شده،‭ ‬کارش‭ ‬را‭ ‬با‭ ‬بریدن‭ ‬دورشته‌ی‭ ‬DNA‭ ‬بر‭ ‬روی‭ ‬هدف‭ ‬مشخصش‭ ‬روی‭ ‬ژنوم‭ ‬به‭ ‬انجام‭ ‬می‌رساند. برخلاف‭ ‬آن،‭ ‬ویرایش‭ ‬باز،‭ ‬دو‭ ‬رشته‌ی‭ ‬DNA‭ ‬را‭ ‬برش‭ ‬نداده‭ ‬و‭ ‬به‭ ‬جای‭ ‬آن‭ ‬از‭ ‬آنزیم‌هایی‭ ‬استفاده‭ ‬می‌کند‭ ‬که‭ ‬به‭ ‬طور‭ ‬دقیق،‭ ‬با‭ ‬جابه‌جا‭ ‬کردن‭ ‬برخی‭ ‬اتم‌ها‭ ‬بازهای‭ ‬DNA‭ ‬و‭ ‬یا‭ ‬RNA‭ ‬را‭ ‬به‭ ‬یکدیگر‭ ‬تبدیل‭ ‬می‌کنند،‭ ‬بدون‭ ‬اینکه‭ ‬لازم‭ ‬باشد‭ ‬بازهای‭ ‬اطراف‭ ‬آن‭ ‬تعویض‭ ‬شوند. این‭ ‬توانایی‭ ‬به‭ ‬مقدار‭ ‬قابل‭ ‬توجهی‭ ‬انتخاب‌ها‭ ‬را‭ ‬در‭ ‬اصلاح‭ ‬ژنتیکی‭ ‬افزایش‭ ‬می‌دهد. اریک‭ ‬سانتیمر،‭ ‬از‭ ‬محققین‭ ‬پیشگام‭ ‬در‭ ‬کریسپر‭ ‬این‭ ‬روش‭ ‬را‭ ‬بسیار‭ ‬کارآمد‭ ‬دانسته‭ ‬است.

بسیاری‭ ‬از‭ ‬بیماری‌های‭ ‬انسانی‭ ‬به‭ ‬دلیل‭ ‬جهش‭ ‬تنها‭ ‬در‭ ‬یک‭ ‬باز‭ ‬رخ‭ ‬می‌دهند. استفاده‭ ‬از‭ ‬روش‭ ‬کریسپر‭ ‬برای‭ ‬تصحیح‭ ‬جهش‌های‭ ‬نقطه‌ای‭ ‬با‭ ‬مشکلات‭ ‬فراوانی‭ ‬همراه‭ ‬بوده‭ ‬و‭ ‬بهینگی‭ ‬لازم‭ ‬را‭ ‬ندارد؛‭ ‬در‭ ‬نتیجه‭ ‬ویرایش‭ ‬باز‭ ‬راه‌حل‭ ‬بهتری‭ ‬را‭ ‬ارائه‭ ‬می‌دهد. پس‭ ‬از‭ ‬گزارش‭ ‬اولیه‭ ‬لیو،‭ ‬گروهی‭ ‬در‭ ‬چین‭ ‬از‭ ‬ویرایش‭ ‬باز‌های‭ ‬DNA‭ ‬برای‭ ‬تصحیح‭ ‬یک‭ ‬‌بیماری‭ ‬در‭ ‬جنین‭ ‬انسانی‭ ‬کلون‭ ‬شده‭ ‬از‭ ‬یک‭ ‬بیمار‭ ‬با‭ ‬نقص‭ ‬ژنتیکی‭ ‬خونی‭ ‬استفاده‭ ‬کردند‭.‬

کریسپر‭ ‬کلاسیک‭ ‬از‭ ‬یک‭ ‬RNA‭ ‬راهنما‭ ‬‮»‬gRNA‮«‬‭ ‬که‭ ‬با‭ ‬یک‭ ‬نوع‭ ‬آنزیم‭ ‬نوکلئاز‭ ‬معمولاً‭ ‬Cas9‭ ‬جفت‭ ‬شده‭ ‬است،‭ ‬استفاده‭ ‬می‌کند. سپس‭ ‬این‭ ‬مجموعه‭ ‬به‭ ‬توالی‭ ‬خاصی‭ ‬از‭ ‬DNA‭ ‬متصل‭ ‬می‌گردد. در‭ ‬این‭ ‬هنگام‭ ‬نوکلئاز‭ ‬مارپیچ‭ ‬دورشته‌ای‭ ‬را‭ ‬قیچی‌‭ ‬می‌کند. مکانیسم‭ ‬باز‌سازی‭ ‬DNA‭ ‬سلول‭ ‬سپس‭ ‬وارد‭ ‬عمل‭ ‬شده‭ ‬و‭ ‬سعی‭ ‬در‭ ‬اتصال‭ ‬قطعات‭ ‬جدا‭ ‬شده‭ ‬می‌کند،‭ ‬با‭ ‬این‭ ‬حال‭ ‬در‭ ‬برخی‭ ‬موارد‭ ‬این‭ ‬فرآیند‭ ‬همراه‭ ‬با‭ ‬اضافه‭ ‬شدن‭ ‬یا‭ ‬حذف‭ ‬برخی‭ ‬دیگر‭ ‬از‭ ‬باز‌ها‭ ‬اتفاق‭ ‬می‌افتد‭ ‬که‭ ‬سبب‭ ‬می‌شود‭ ‬تا‭ ‬رمز‭ ‬DNA‭ ‬به‭ ‬کدی‭ ‬نامفهوم‭ ‬تبدیل‭ ‬شده‭ ‬و‭ ‬ژن‭ ‬هدف‭ ‬از‭ ‬بین‭ ‬برود. فنگ‭ ‬ژنگ‭ ‬در‭ ‬این‭ ‬باره‭ ‬می‌گوید‭:‬

ویرایش‭ ‬ژنی‭ ‬بر‭ ‬پایه‭ ‬نوکلئاز‭ ‬اغلب‭ ‬در‭ ‬غیرفعال‭ ‬ساختن‭ ‬ژن‌ها‭ ‬مؤثر‭ ‬است‭.‬

درحال‭ ‬حاضر‭ ‬کریسپر‭ ‬در‭ ‬ایجاد‭ ‬تغییرات‭ ‬دقیق‭ ‬آن‌چنان‭ ‬مؤثر‭ ‬نیست. برای‭ ‬تصحیح‭ ‬جهش‭ ‬نقطه‌ای،‭ ‬علاوه‭ ‬بر‭ ‬سیستم‭ ‬کریسپر‭-‬Cas9‭ ‬باید‭ ‬توالی‭ ‬سالمی‭ ‬از‭ ‬ژن‭ ‬مورد‭ ‬نظر‭ ‬تحت‭ ‬عنوان‭ ‬توالی‭ ‬‮«‬دهنده‮»‬‭ ‬همراه‭ ‬با‭ ‬کمپلکس‭ ‬کریسپر‭ ‬ارائه‭ ‬گردد. سپس‭ ‬موفقیت‭ ‬فرآیند‭ ‬وابسته‭ ‬به‭ ‬مکانیسم‭ ‬سلولی‭ ‬موسوم‭ ‬به‭ ‬HDR‭ ‬یا‭ ‬Homology-directed repair‭ ‬خواهد‭ ‬بود. اما‭ ‬این‭ ‬فرآیند‭ ‬تنها‭ ‬در‭ ‬هنگام‭ ‬تقسیم‭ ‬سلولی‭ ‬به‌طور‭ ‬مناسب‭ ‬فعالیت‭ ‬می‌نماید. این‭ ‬بدان‭ ‬معناست‭ ‬که‭ ‬این‭ ‬مکانیسم‭ ‬در‭ ‬سلول‌هایی‭ ‬مانند‭ ‬تار‌های‭ ‬ماهیچه‌ای‭ ‬و‭ ‬نورون‌ها‭ ‬مؤثر‭ ‬نخواهد‭ ‬بود. همچنین‭ ‬در‭ ‬صورت‭ ‬تقسیم‭ ‬سلول‌ها‭ ‬نیز‭ ‬تنها‭ ‬در‭ ‬تعداد‭ ‬اندکی‭ ‬از‭ ‬سلول‌ها‭ ‬DNA‭ ‬دهنده‭ ‬به‭ ‬محل‭ ‬برش‭ ‬اضافه‭ ‬می‌گردد.

بخشی‭ ‬از‭ ‬اجزای‭ ‬تشکیل‭ ‬دهنده‌ی‭ ‬سیستم‭ ‬ویرایش‭ ‬باز،‭ ‬مشابه‭ ‬با‭ ‬اجزای‭ ‬کریسپر‭ ‬است. از‭ ‬جمله‭ ‬این‭ ‬موارد،‭ ‬gRNA‭ ‬و‭ ‬پروتئین‭ ‬Cas9‭ ‬می‌باشند. با‭ ‬این‭ ‬حال‭ ‬در‭ ‬این‭ ‬سیستم‭ ‬به‭ ‬جای‭ ‬برش‭ ‬هر‭ ‬دو‭ ‬رشته‌ی‭ ‬،DNA‭ ‬تنها‭ ‬باز‌ها‭ ‬به‭ ‬کمک‭ ‬آنزیم‌های‭ ‬دآمیناز‭ ‬تغییر‭ ‬داده‭ ‬می‌شوند. از‭ ‬جمله‭ ‬این‭ ‬آنزیم‌ها‭ ‬می‌توان‭ ‬به‭ ‬TadA‭ ‬و‭ ‬ADAR‭ ‬اشاره‭ ‬نمود. DNA‭ ‬چهار‭ ‬نوع‭ ‬باز‭ ‬نوکلئوتیدی‭ ‬دارد‭ (‬A‭ ‬،C‭ ‬،T‭ ‬و‭ ‬G‭) ‬و‭ ‬ویرایش‭ ‬باز‭ ‬آن‌ها‭ ‬را‭ ‬به‭ ‬یکدیگر‭ ‬تبدیل‭ ‬می‌کند. در‭ ‬طی‭ ‬تحقیق‭ ‬لیو‭ ‬در‭ ‬سال‭ ‬۲۰۱۶ ،‭‬تیم‭ ‬او‭ ‬gRNA‭ ‬را‭ ‬به‭ ‬یک‭ ‬Cas9‭ ‬مرده‭ (‬dCas9‭) ‬الحاق‭ ‬کردند‭.‬

‭ ‬dCas9‭‬توانایی‭ ‬برش‭ ‬کل‭ ‬دو‭ ‬رشته‭ ‬را‭ ‬ندارد‭ ‬ولی‭ ‬می‌تواند‭ ‬آن‭ ‬را‭ ‬در‭ ‬محل‭ ‬صحیح‭ ‬از‭ ‬هم‭ ‬باز‭ ‬کند. برای‭ ‬انجام‭ ‬چنین‭ ‬عمل‭ ‬پیچیده‌ای،‭ ‬محققان‭ ‬از‭ ‬آنزیمی‭ ‬به‭ ‬نام‭ ‬APOBEC1‭ ‬استفاده‭ ‬کردند‭ ‬که‭ ‬با‭ ‬یک‭ ‬سری‭ ‬واکنش‌ها،‭ ‬باز‭ ‬C‭ ‬را‭ ‬به‭ ‬T‭ ‬تبدیل‭ ‬می‌نماید. همچنین،‭ ‬تبدیل‭ ‬باز‭ ‬G‭ ‬در‭ ‬رشته‌ی‭ ‬مقابل‭ ‬به‭ ‬،A‭ ‬در‭ ‬اثر‭ ‬تحریک‭ ‬سیستم‭ ‬ویرایش‭ ‬ذاتی‭ ‬خود‭ ‬سلول‭ ‬به‭ ‬انجام‭ ‬می‌رسد. با‭ ‬اولین‭ ‬ویرایشگر‭ ‬باز‭ ‬DNA‭ ‬که‭ ‬شرح‭ ‬داده‭ ‬شد،‭ ‬نمی‌توان‭ ‬بیشتر‭ ‬جهش‌های‭ ‬مرتبط‭ ‬با‭ ‬بیماری‌های‭ ‬انسان‭ ‬را‭ ‬برطرف‭ ‬کرد. ولی‭ ‬به‌نظر‭ ‬می‌رسد‭ ‬این‭ ‬مشکل‭ ‬هم‭ ‬برطرف‭ ‬شده‭ ‬است.

گروه‭ ‬لیو‭ ‬بار‭ ‬دیگر‭ ‬gRNA‭ ‬را‭ ‬با‭ ‬یک‭ ‬dCas9‭ ‬ترکیب‭ ‬کردند،‭ ‬اما‭ ‬این‭ ‬بار‭ ‬آنزیمی‭ ‬وجود‭ ‬نداشت‭ ‬که‭ ‬A‭ ‬را‭ ‬به‭ ‬G‭ ‬تبدیل‭ ‬کند. بنابراین محققان آنزیم جدیدی را از TadA (آنزیمی در باکتری E.Coli) ایجاد نمودند که باز A را به اینوزین (I) تبدیل می‌کند. سیستم ویرایش همانندسازی DNA در خود سلول زحمت تبدیل باز I به G را خواهد کشید. جورج چرچ که در هاروارد روی کریسپر تحقیق می‌کند، در این باره می‌گوید:

کار اصلی مهندسی آنزیم TadA است تا فرآیندی کاملاً غیرطبیعی را انجام دهد. من به احترام کسانی که این کار را کرده‌اند، کلاه از سر خود برمی‌دارم!