ژن‌ درمانی آلرژی (۲)

هدف‌گذاری سیتوکاین‌های T_H۲ مدیاتورهای التهابی

با توجه به نقش کلیدی ستوکاین‌های T_H۲ در هدایت التهاب آلرژيک، این مواد اهداف درمانی مهمی هستند. مهارکننده‌های سیتوکاین به شکل آنتی‌بادی‌های مونوکلونال یا آنتاگونیست‌های ملکولی کوچک، برای درمان آسم ساخته شده‌اند و بسیلری از آن‌ها همچنان در مراحل پری-‌کلینیکی هستند. تا کنون موفقیت‌های این رویکرد درمانی محدود بوده است و تعداد بسیار کمی از آن‌ها به مرحله کارآزمایی بالینی رسیده‌اند. مشکلی که دربرابر این رویکرد درمانی وجود دارد رسیدن به دوز مطلوبی است که بدون ایجاد عوارض جانبی نتایج بالینی موثری داشته باشد؛ اما علاوه بر آن با توجه به تعداد زیاد سایتوکاین‌ها و مسیرهای درگیر، هدف‌گذاری یک مدیاتور یا گیرنده‌ی منفرد کافی نیست. اگرچه به خصوص در فنوتیپ‌های خاص آسم با سطح بالایی از این مدیاتورها (مثل IL-5، IL-13 یا IL-4) این درمان‌های می‌توانند مفید باشند و هدف‌گذاری میدیاتورها از طریق ژن‌درمانی می‌تواند جایگزینی امید بخشی برای درمان کنونی با آنتی‌بادی باشد.

اخیراً مشخص شده است که درمان آنتی‌بادی ضد IL-5 میزان تشدید بیماری را در زیرگروهی از بیماران آسم شدید، کاهش می‌دهد؛ در این زیرگروه التهاب ائوزینوفیلی مسیرهای هوایی و عود تشدید شونده بیماری دیده می‌شود. در مطالعات پری-کلینیکی رویکردهای متعددی برای هدف‌گذاری IL-5 از طریق ژن‌درمانی صورت گرفته است. تجویز درون نایی لنتی‌ویروس‌های بیان کننده   siRNA  برای IL-5 افزایش حساسیت مسیر هوایی (AHR)، تصفیه سلولی بافت ریه و در مدل‌های آزمایشگاهی التهاب آلرژی mRNA   ریوی IL-5، را کاهش می‌دهد. تجویز سیستمیک آنتی‌سنس IL-5 یا آنتی‌سنس IL-4 انتقال یافته از طریق یک AAV نوترکیب، بیان IL-4 یا IL-5، التهاب آلرژیک و بازسازی مسیرهوایی را کاهش می‌دهد. اگرچه برای رسیدن به اثرات بالینی چشمگیر، هدف‌گذاری مدیاتورهای متعدد یا مسیرهای سیگنالینگ بهتر خواهد بود. بلوکه کردن همزمان سیگنالینگ IL-13 و IL-4 از طریق یک الیگونوکلئوتید آنتی‌سنس علیه زنجیره آلفا گیرنده IL-4 (IL-4R-α)، علایم متعددی از آسم را در مدل‌های آزمایشگاهی کاهش داده است. یک مطالعه فاز اول که نبولایزر AIR645  (آنتی‌سنس  IL-4R-α) را روی داوطلبان غیربیمار و بیماران با آسم خفیف آزمایش می‌کرد، نشان داد که  این نبولایزر تحمل‌پذیری بالا، اثرات سیستمیک پایین و دارای پتانسیل درمانی یک هفته‌ای می‌باشد.

کنترل آلرژي از طریق فاکتورهای رونویسی اصلی

یک رویکرد جالب دیگر برای کاهش پاسخ ایمنی آلرژي هدف‌گذاری فاکتورهای رونویسی‌ای است که پاسخ‌های T_H۲ را القا می‌کنند.

STAT: خانواده STAT^۱ از فاکتورهای رونویسی، در بسیاری از فرآیندهای سیگنالینگ درگیر هستند. آن‌ها از طریق فعال کردن فاکتورهای رونویسی معمول سلول T (T-BET، GATA-3، FoxP3 و ROR γτ) نفش مهمی در تمایز سلول‌های T دارند؛ بنابراین اهداف درمانی بالقوه‌ای هستند. فعال شدن STAT6 برای تمایز naïve T-cell به سلول‌های اثرگذار T_H۲، حیاتی است. STAT6 همچنین تولید کموکاین‌های T_H۲ القا شده توسط IL-13 و IL-4 را از سلول‌های اپیتلیال، فیبروبلاست‌ها و سلول‌های ماهیچه صاف، تنظیم می‌کند. در طول التهاب ریوی آلرژيک، STAT6 برای لنفوسیت‌های و لانه‌گزینی ائوزینوفیل‌ها در مسیرهای هوایی لازم است و بیان آن در سلول‌های اپیتلیال ریه موجب تولید موکوس و افزایش حساسیت مسیر هوایی می‌شود. بنابراین مهار موضعی بیان STAT6 یک استدلال منطقی برای مداخلات درمانی آسم برونشیولی است. مطالعات آزمایشگاهی نشان داده است که بیان mRNA ائوتوکسین از طریق سلول‌های اپیتلیال ریوی از پیش‌ فعال‌شده توسط IL-13 و IL-4 به وسیله حذف بیان STAT6 (از طریق siRNA STAT6)، متوقف می‌شود. این نشان می‌دهد که سلول‌های موکوزی که دچار التهاب ریوی ناشی از آسم مزمن هستند نیز به این رویکرد درمانی پاسخ می‌دهند. تجویز اینترانازال siRNA برهنه علیه STAT6 به مدل‌های آزمایشگاهی حساس شده، دقیقاً قبل و در طول قرار گرفتن در معرض آرژن، به طور چشمگیری التهاب ناشی از آلرژن، هایپرپلازی سلول‌های جامی و افزایش حساسیت مسیرهای هوایی را مهار می‌کند. آزمایشی دیگر روی مدل آزمایشگاهی رنیتیت آلرژیک نیز پتانسیل درمانی هدف‌گذاری STAT6 را تایید کرده است. این مطالعات پری-کلینیکی نشان می‌دهد که STAT6 یک هدف امیدوارکننده برای درمان آلرژي مسیرهوایی است؛ اما تاکنون هیچ کارآزمایی بالینی برای این رویکرد درمانی انجام نشده است.

GATA-3: پتانسیل درمانی بلوکه کردن GATA-3، فاکتور رونویسی تمایز T_H۲ که بیان IL-4، IL-5 و IL-13 را تنظیم می‌کند، یک دهه قبل هنگام مطالعه روی موش‌های آزمایشگاهی التهاب آلرژیک و اثر درمانی الیگونوکلئوتیدهای آنتی‌سنس، مشخص شده بود. سنجاق‌سرهای کوتاه RNA و کاتالیتیک DNA اختصاصی GATA-3 نیز توانسته‌اند التهاب آلرژیک در مدل‌های آزمایشگاهی تقلیل دهند. مقایسه DNA کاتالیتیک با دیگر تکنیک‌های برش ژنی اثبات کرده است که این روش موثرترین روش است و اثرات ناخواسته ندارد؛ بنابراین این تکنیک فرصت‌های جدیدی را در این زمینه ایجاد می‌کند.

NF-κβ: یکی دیگر از فاکتورهای رونویسی است و باور بر این است که نقش مهمی در بسیاری از بیماری‌های التهابی حاد و مزمن، ازجمله آسم، دارد. NF-κβ در سلول‌های متعددی بیان می‌شود و بیان بسیاری از ژن‌های پیش التهابی را کنترل می‌کند؛ ژن‌هایی که موجب سنتز سیتوکاین‌ها، ملکول‌های ادهزین، فاکتورهای رشد و آنزیم‌ها می‌شوند. مطالعات آزمایشگاهی برای هدف‌گذاری NF-κβ با استفاده از الیگونوکلئوتیدهای آنتی‌سنس P65، روی مدل‌های آزایشگاهی انجام شده است؛ اما پیشرفت چشمگیری در این زمینه برای ورود به مرحله کلینیکی، تاکنون وجود نداشته است.

هدف‌گذاری فاکتورهای رونویسی با الیگونوکلئوتیدهای تله‌ای: یک روش دیگر برای مهار بیان ژن هدف، استفاده از الیگونوکلئوتیدهای تله‌ای است. این الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی و دو رشته‌ای کوتاه، جایگاه‌هایی برای اتصال فاکتور رونویسی دارند که توسط فاکتورهای رونویسی هسته شناسایی می‌شوند. اتصال الیگونوکلئوتیدهای تله‌ای مانع از اتصال موثر فاکتورهای رونویسی به توالی ژن هدف‌شان می‌شود، و بدین تریتیب از بیان ژن جلوگیری می‌شود. مطالعاتی روی مهار فاکتورهای رونویسی STAT-1 و STAT-3 به کمک این الیگونوکلئوتیدها انجام شده است که نتایج مفیدی از جمله کاهش التهاب آلرژيک و کاهش بیان CD40 ریوی را در پی داشته است.

هدف‌گذاری microRNA

miRNAها ترجمه بسیاری از ژن‌ها را کنترل می‌کنند و بنابراین در تنظیم آسم و آلرژي القا شده توسط پاسخ‌های T_H۲ نیز نقش دارند. miR-21، miR-126 و miR-13a با پاتوژنسیته‌ی آسم مرتبط هستند، بلوکه کردن آن‌ها از طریق الیگونوکلئوتیدهای ضد miR (antagomirs) می‌تواند افزایش حساسیت (AHR) و بسیاری از نشانه‌های اصلی التهاب آلرژيک را سرکوب کند.

هدف‌گذاری سلول‌های عرضه کننده آنتی‌ژن و یا عملکرد سلول T_H۲

با درنظر گرفتن نقش کلیدی سلول‌های دندریتیک در آغاز و تداوم پاسخ‌های T_H۲، آن‌ها نیز اهداف مناسبی برای درمان بیماری‌های آلرژی مسیرهوایی هستند. القا مناسب پاسخ‌های سلول T علاوه بر عرضه آنتی‌ژن توسط سلول‌های دندریتیک، به موارد دیگری نیز نیازمند است. برای القا تقسیم و تمایز سلول T، طول مدت و قدرت تداخل بین سلول دندریتیک و سلول T نیز باید کافی باشد. در کنار فعالیت سلول‌های دندریتیک، تحریک همزمان ملکول‌هایی مانند CD80، CD86 و CD40 این سیگنال‌های اضافی مورد نیاز را تامین می‌کند. در مدل‌های آزمایشگاهی مبتلا به آسم، هدف‌گذاری CD86 از طریق الیگونوکلئوتیدهای آنتی‌سنس استنشاق شده، بیان CD86 را در سلول‌های دندرتیک، ماکروفاژها و ائوزینوفیل‌ها سرکوب کرده و AHR، التهاب ریوی، تولید موکوس و سطح ائوتوکسین را کاهش داد. در موش آزمایشگاهی مبتلا به رنیتیت آلرژيک، هدف‌گذاری CD40 از طریق siRNA با مهار عملکرد سلول‌های دندریتیک و سلول‌های B و القای پاسخ سلول T تنظیمی، علایم آلرژی، التهاب ائوزینوفیلی و تولید ایمونوگلوبین کاهش یافت. می‌توان سلول‌های دندریتیک را به تنهایی هدف‌گذاری کرد، بدین ترتیب که سلول‌های دندریتیک اختصاصی آلر‌ژن که در آزمایشگاه (و خارج از بدن موجود زنده) CD40 آن‌ها خاموش شده است، تزریق می‌شود؛ در این روش رنیتیت آلرژيک تثبیت شده نیز می‌تواند بهبود یابد و ساخت سلول‌های T تنظیمی اختصاصی آلرژن هم افزایش می‌یابد. با این کار می‌توان ژن‌درمانی و درمان اختصاصی آلرژن را ترکیب کرد. این روش بسیار امید بخش است اما همچنان بررسی‌های بالینی بیشتری مورد نیاز است.

علاوه بر موارد گفته شده، با تمرکز بیشتر روی تقابل بین سلول دندریتیک و سلول‌های T، می‌توان عملکرد خود سلول‌های T را نیز هدف‌گذاری کرد. مطالعات اخیر نشان داده است که سلول‌های T_H۲ به طور اختصاصی کانال‌های وابسته به ولتاژ کلسیم را بیان می‌کنند، این مورد آن‌ها را یک هدف اختصاصی و مناسب برای درمان می‌سازد. مهار این کانال‌ها از طریق الیگونوکلئوتیدهای آنتی‌سنس روی یک آسم فعال موثر بود و بدون اثر روی پاسخ‌های سلول T_H۱، مانع از التهاب مسیرهای هوایی و فعال‌سازی T_H۲ و افزایش حساسیت (AHR) شد.

هدف‌گذاری کینازها

بسیاری از کینازها در پاتوژنز آلرژي مسیرهوایی دخالت دارند. کینازهایی مانند پروتئين کیناز فعال‌شده با میتوژن (MAPK) و NF-κβ در تنظیم بیان ژن‌های التهابی که هنگام آسم بیش از اندازه بیان می‌شوند، مهم هستند. در مقابل فسفواینوزیتید ۳-کیناز (PI3K) در کاهش پاسخگویی استروئيد دخیل است. تیروزین کیناز طحال (Syk) در فعال‌سازی ماست‌سل‌ها و دیگر سلول‌های ایمنی دخیل است. بنابراین بسیاری از ملکول‌های کوچک مهارکننده‌ی کینازها پتانسیل درمانی دارند. البته از آنجایی که مسیرهای ترانسداکشن کیناز سیگنالینگ در بسیاری از انواع سلول‌ها حضور دارند، تجویز سیستمیک مهارکننده‌ها عوارض جانبی به دنبال خواهد داشت، طراحی و ساخت مهارکننده‌های تنفسی اثرات درمانی بهتری خواهد داشت. ژن‌درمانی با مهار اختصاصی و موضعی این کینازها در اجزای مسیرهوایی مداخله درمانی مهمی را برای آینده رقم می‌زند. مهار موفقیت‌آمیز کیناز Syk توسط الیگونوکلئوتیدهای آنتی‌سنس آیروزول در موش‌های آزمایشگاهی، اثباتی برای این استراتژی است (دانشمندان درتلاش‌اند siRNAهای موثرتری را نیز طراحی کنند). اسفینگوزین کیناز (SphK) سطح اسفنگولیپید بین سلولی را پس از فعال‌سازی گیرنده‌های غشایی متعدد، تنظیم می‌کند. SphK برای مهاجرت لنفوسیت‌ها و ائوزینوفیل‌ها و آزادسازی ترکیبات از گرانول‌های ماست‌سل‌ها مهم است. بلوکه کردن SphK از طریق siRNA التهاب ریوی، سیتوکاین‌های T_H۲ و IgE  اختصاصی  آلرژن را کاهش می‌دهد.

علاوه بر کینازها، اخیراً نقش کیتیناز اسیدی پستانداران (AMCase) در آلرژی مسیرهای هوایی شناسایی شده است. بلوکه کردن AMC (که در سلول‌های اپیتلیال ریه و ماکروفاژهای آلوئولار بیان می‌شود) از طریق تداخلات RNA، التهاب آلرژيک مسیرهوایی و افزایش حساسیت را بهبود می‌بخشد.

بیان بیش از حد ترانس‌ژن درمقابل التهاب T_H۲

علاوه بر استفاده از تکنیک‌های برش ژنی برای هدف‌گذاری فاکتورهایی که در التهاب آلرژیک دخیل هستند، رویکرد درمانی دیگر بیان ترانس‌ژنی سایتوکاین‌ها، فاکتورهای تنظیمی ایمنی یا فاکتورهای رونویسی است که فرآیند بیماری التهابی را مهار می‌کنند. در طی مطالعات گذشته التهاب آلرژيک به طور موفقیت‌آمیزی از طریق بیان بیش از حد TGF-β، IFN-γ، IL-10، IL-18 و آنتاگونیست گیرنده‌ی IL-1، کاهش داده شده است. انتقال این ژن‌ها از طریق پلازمیدها و وکتورهای آدنوویروسی انجام می‌گیرد. موارد زیر مختصری از پیشرفت‌های اخیر در این زمینه است.

آنتاگونیست گیرنده‌ی IL-4 (IL-4RA): IL-4RA شکل جهش‌یافته‌ی IL-4 جوندگان است که با اتصال به IL-4R-α، به عنوان یک آنتاگونیست رقابتی برای سیگنالینگ IL-4 و IL-13 عمل می‌کند. تجویز درون نایی ژن IL-4RA روی یک پلازمید در موش‌های آزمایشگاهی، التهاب مسیرهوایی را کاهش داده و تعادل T_H۱/T_H۲ را تنظیم کرده است.

 IL-10 و IL-12: IL-12 سلول‌های T پیشرو را به سمت تمایز به T_H۱ هدایت می‌کند، و IL-10 بیان بسیاری از سایتوکاین‌های پیش التهابی و کموکاین‌ها را مهار می‌کند. IL-10 اصلی‌ترین سایتوکاینی است که توسط سلول‌های T تنظیمی تولید می‌شود. تزریق درون ماهیچه‌ای پلازمید IL-12 و تجویز درون نایی آدنوویروس ترکیبی که IL-10 و IL-12 را بیان می‌کند، التهاب مسیرهوایی و AHR را در موش‌های آزمایشگاهی کاهش داده است. بیان ترکیبی IL-10 و IL-12 از عوارض جانبی ناشی از بیان بیش از حد IL-12 منفرد جلوگیری می‌کند؛ از آنجایی که برهم زدن تعادل سایتوکاین‌ها از طریق ژن‌درمانی می‌تواند موجب عوارض جانبی شود، مسئله ایمنی و میزان تاثیر این روش موضوعی است که موجب نگرانی‌هایی را در پی دارد.

IFN-γ: سال‌ها پیش مشخص شده بود که ذرات نانوژن کیتوسان IFN-γ (CIN)، پلی‌ساکاریدهای کاتیونیکی که پلازمید IFN-γ برای انتقال ژن حمل می‌کنند، آلرژي مسیرهای هوایی را کاهش می‌دهند، اگرچه مکانیسم دقیق آن معلوم نبود. مطالعات اخیر نشان می‌دهد که CIN تولید سایتوکاین از سلول‌های CD8 ⁺ T را تغییر داده و ظرفیت عرضه آنتی‌ژن سلول‌های دندیریتیک را کاهش می‌دهد.

T-BET: بیان بیش از حد تنظیم‌کننده‌ی اصلی T_H۱ از طریق انتقال اینترانازال ویروس AAV نوترکیب با T-bet جوندگان، التهاب مسیرهوایی را در موش‌های آزمایشگاهی کاهش می‌دهد.

با وجود تمام پیشرفت‌های ذکر شده در زمینه ژن‌رمانی آلرژي، قبل از اینکه ژن‌درمانی بتواند به عنوان درمانی برای آسم یا رنیتیت آلرژیک در نظر گرفته شود موانع تکنیکی و انیتی بسیار باید پشت سر گذاشته شود:

۱. ملکول‌های آنتی‌سنس یا ملکولهای siRNA مناسب برای استراتژي برش ژن در انسان‌ها باید به طور دقیق طراحی شده و از نظر اختصاصی بودن در مدل‌های آزمایشگاهی آزمایش شود.

۲. برای استفاده از استراتژی‌های برش ژن، سمیت عوامل تثبیت کننده باید کاهش یابد و ترانسفکشن‌های آزمایشگاهی موثرتری باید شناسایی شود.

۳. مدت زمان تاثیر ژن‌درمانی با استفاده از استراتژي‌های هدف‌گذری متفاوت، باید در مدل‌های پری کلینیکی مختلفی بررسی شود.

۴. مزایا و معایب انتقال ریوی عوامل ژن‌درمانی باید نسبت به هدف‌گذاری خارج از بدن انواع سلولی سنجیده شود، در کنار آن تجویز به بیماران نیز باید به طور دقیق ارزیابی شود.

۵. در موارد مزمن که نیازمند رویکردهای چندگانه هستند، اثرات ناخواسته و پاسخ‌های ایمنی باید کنترل شود.

با اینکه بسیاری از رویکردهای پری‌کلینیکی دارای پتانسیل درمانی هستند، تلاش برای درمان آلرژی مسیرهوایی از طریق ژن‌درمانی همچنان با محدودیت‌هایی روبرو است. مسائل اخلاقی ژن‌درمانی، موثر بودن نسبی روش‌های موجود کنترل آلرژي در اغلب بیماران، و موانع ایمنی و تکنیکی می‌تواند توضیحی برای عدم ترغیب به انجام کارآزمایی‌های ژن‌درمانی آلرژی باشد. انتظار نمی‌رپد که در آینده‌ی نزدیک ژن‌درمانی تبدیل به جایگزینی برای درمان‌های کورتیکواستروئيدی‌ای شود که برای بیشتر بیماران آسمی کارآمد هستند (هرچند که یک علاج دائمی نمی‌باشند). اما برای برخی از زیرگروه‌های آسمی، آسم‌های شدید با بیان بیش از حد یک سایتوکاین یا مدیاتور خاص، که درمان‌های موجود برای آن‌ها موثر نیست ژن‌درمانی می‌تواند گزینه دیگری علاوه بر درمان‌هایی باشد که به کار می‌برند. که این ژن‌درمانی دارای مزایایی مانند طولانی‌مدت بودن اثر درمان،کنترل بهتر علایم بیماری و کاهش داروهای مصرفی است. به طور کلی، اگرچه ژن‌درمانی هنوز یک گزینه درمانی محسوب نمی‌شود، پیشرفت‌های امیدبخش اخیر حاکی از این است که برای بیماران آسمی که آسم آن‌ها غیرقابل کنترل بوده و درمان‌ آن‌ها با مشکل مواجه است، ژن‌درمانی می‌تواند در آینده پاسخ درمانی مناسبی برای‌شان باشد.