انتشار این مقاله


معرفی qPCR arrayها

امروزه مطمئن‌ترین ابزاری که برای آنالیز الگوی بیان پنل متمرکزی از ژن‌ها به صورت موازی وجود دارد، qPCR array می‌باشد. این arrayها برای تهیه پروفایل بیان ژن mRNAها و microRNAها به کار می‌روند. mRNAها و miRNAها دارای نقش‌هایی اساسی در فرایندهای مختلف بیولوژیکی می‌باشند. از این‌رو تهیه پروفایل این مولکول‌ها می‌تواند به عنوان ابزاری مهم […]

امروزه مطمئن‌ترین ابزاری که برای آنالیز الگوی بیان پنل متمرکزی از ژن‌ها به صورت موازی وجود دارد، qPCR array می‌باشد. این arrayها برای تهیه پروفایل بیان ژن mRNAها و microRNAها به کار می‌روند. mRNAها و miRNAها دارای نقش‌هایی اساسی در فرایندهای مختلف بیولوژیکی می‌باشند. از این‌رو تهیه پروفایل این مولکول‌ها می‌تواند به عنوان ابزاری مهم در تشخیص miRNAها و mRNAهایی که در بیماری‌ها بیان متفاوتی پیدا می‌کنند، واقع شود. این تکنیک دارای مزایایی نسبت به سایر تکنیک‌های آنالیز بیان ژن مانند استفاده از microarrayها می‌باشد، که از جمله آن‌ها حل مشکلات تکنیکی مربوط به آنالیز در مقادیر ورودی بالا است. از تکنولوژی‌های مرتبط با PCR arrayها، SABioscience RT2 Profiler PCR Arrayها هستند که دارای سیستمی کامل به منظور آنالیز بیان ژن به صورت متمرکز بر مسیر می‌باشند.

qPCR array در فرمت‌های ۹۶-well، ۳۸۴-well و ۱۵۳۶-well موجود بوده و روش‌های شیمیایی تشخیصی به کار رفته در آن، عبارتند از: SYBR Green I یا سایر رنگ‌های متصل‌شونده به DNA مشابه و یا مجموعه پرایمری probe-based  (مانند پروب‌های TaqMan یا LNA). این arrayها می‌توانند پنلی محتوی microRNAهای بیان شده را به طور کامل غربالگری نموده و یا یک sub-panel معین مانند خانواده‌های ژنی مرتبط با مسیر یا بیماری خاصی را مورد بررسی قرار دهند. qPCR array ها همچنین می‌توانند به گونه‌ای طراحی شوند که حاوی پنلی از ژن‌های موردنیاز برای مطالعه‌ای خاص باشند.

چرا از qPCR array ها استفاده می‌کنیم؟

qPCR array ها می‌توانند پروفایل بیان ژن پنلی از ژن‌های مرتبط با مسیر یا بیماری خاصی را تهیه کنند. متد ساده‌ای مانند PCR مزیت تکنیک qRT-PCR را که حساسیت بالا و دامنه وسیع سنجش است، دارا می‌باشد. در صورتیکه تکنیک ذکرشده به طور کامل به انجام برسد، سنجش کمیت را با قابلیت بازتولید بالایی به انجام خواهد رساند. همچنین این تکنیک، مخصوص کاربردهایی طراحی می‌شود که ظرفیت ورودی بالایی داشته و در موارد روتین به کار می‌روند. درنتیجه می‌توانند در تمام آزمایشگاه‌هایی که در آن‌ها تجهیزات real-time PCR وجود دارد، استفاده شوند.

حساسیت این روش، چیزی در حدود ۱ نانوگرم در هر واکنش یا ۵ میکروگرم از RNA توتال در کل هر array است و قادر به شناسایی بیش از ۸۰ درصد سلول‌های حاضر می‌باشد. قابلیت بازتولید بالای این تکنیک به آن معناست که نمونه‌های آزمایشی می‌تاونند در بین arrayهای مختلف، با درجه اطمینان بالایی مقایسه شوند. اختصاصیت بالای این تکنیک که با ترکیب پرایمرهای SYBR Green و سایر مواد اولیه حاصل می‌شود، تولید تنها یک محصول، آن‌ هم با اندازه مورد انتظار را در هر واکنش ضمانت می‌کند و شاهد تولید محصولاتی مانند دایمرهای پرایمر نخواهیم بود.

qPCR array به علت حساسیت و اختصاصیت بالای خود، به عنوان متدی gold standard در تایید داده‌های حاصل از بررسی بیان ژن‌ها، به کار می‌رود. در دسترس بودن این تکنیک، آن را به متد انتخابی در تهیه  پروفایل بیان mRNA و miRNAها تبدیل کرده است. مطالعاتی که تکنیک qPCR array را با DNA microarray مقایسه کرده اند، نشان از پایین‌تر بودن حساسیت و اختصاصیت DNA microarray و بالاتر بودن نتایج مثبت کاذب در آن دارند. در نتیجه داده‌های حاصل از آن  باید با احتیاط تفسیر و با متدهایی همچون qRT-PCR تایید شوند.

qPCR array چگونه انجام می‌شود؟

طی این فرایند، cDNA الگو با مخلوط آماده‌ای از مواد اولیه PCR ترکیب شده و مقادیر یکسانی از آن در هر کدام از چاهک‌های array ریخته می‌شود. طبق یکی از مطالعات صورت گرفته، تکثیر miRNA cDNAها پیش از افزودن به واکنش، خواهد توانست حساسیت qPCR array و تعداد miRNAهای قابل تشخیص را افزایش داده و آستانه تشخیصی را نسبت به qPCR array بدون مرحله pre-amplification پایین بیاورد. این موضوع خصوصا در مواردی که مقدار نوکلئیک‌اسید اولیه اندک می‌باشد، اهمیت فراوانی دارد. البته این مورد هیچ سوگیری سیستمیکی را در تخمین نسبت‌های بیان RNAها ایجاد نخواهد کرد.

مشکلی که در ارتباط با مرحله pre-amplification ممکن است ایجاد شود، احتمال تکثیر نابرابر رونوشت‌های مختلف است که در صورت پایین بودن مقدار RNA اولیه بیشتر به چشم خواهد خورد. توالی و طول پرایمر و پروب و نیز سطوح پایین بیان RNAها و CT value بالا در آن‌ها، می‌تواند بر کارایی این مرحله تاثیر داشته باشد. درنتیجه، داده‌های حاصل از انجام این تست به همراه مرحله pre-amplification روی مقادیر پایین RNA، باید با احتیاط تفسیر شده و در توسط تست‌هایی مستقل تایید گردند.

در مرحله بعدی، چرخه real-time PCR آغاز می‌گردد. qPCR array ها با تمام سیستم‌های block-based چرخه‌های real-time PCR سازگار هستند. این array ها در فرمت‌های ۹۶-well، ۳۸۴-well و ۱۵۳۶-well موجود بوده و برای مانیتور بیان ۸۴ تا ۱۰۰۰ ژن مرتبط با بیماری یا مسیری خاص استفاده می‌شوند. در هر کدام از arrayها کنترل‌هایی نیز به منظور بررسی آلودگی DNA ژنومی، کیفیت RNA و کارایی عمومی PCR افزوده می‌شود. این کنترل‌ها عبارتند از: چندین ژن رفرنس برای نرمالیزاسیون با ژن‌های رفرنس تاییدشده در تست‌های پیشین، کنترل‌هایی به منظور بررسی آلودگی DNA (DNA carry-over control)، کنترل‌های رونوشت‌برداری معکوس (RT control)، کنترل‌های مثبت PCR.

array-PCR
تصویر ۱. مراحل تکنیک qPCR array توسط RT² Profiler PCR Array؛ ۱. RNA توتال به cDNA تبدیل می‌گردد. ۲. cDNA به RT2 SYBR Green Master Mix افزوده می‌گردد. سپس ترکیب حاصل در چاهک‌های array ریخته می‌شود. ۳. دستگاه real-time PCR راه‌اندازی می‌شود. ۴. داده‌ها آنالیز می‌گردند.

نرمالیزاسیون و آنالیز داده‌های مربوط به پروفایل‌های بیان ژن

آنالیز داده‌ها می‌تواند به سادگی و به کمک Excel صورت گرفته و یا از متد GPR و نرم‌افزارهای پیچیده آنالیزی مانند Genex (MultiD, Sweden) بهره بگیرد. آنالیز داده‌ها اساسا بر پایه متد ΔΔCt method (Livak & Schmittgen, 2001) بوده و طی آن نرمالیزاسیون داده‌های خام با ژن‌های housekeeping و یا کنترل RNA خارجی انجام می‌شود.

RT² Profiler PCR Array ها

این arrayها توسط SABiosciences ارائه شده‌اند و بیان پنل‌هایی از ژن‌های مرتبط با بیش از ۱۰۰ مسیر بیولوژیکی، مسیرهای انتقال سیگنال یا بیماری را با بهره‌گیری از real-time PCR آنالیز می‌کنند و مطمئن‌ترین و حساس‌ترین تکنولوژی موجود برای انجام این کار است. این تکنیک می‌تواند در مطالعات سرطان، سلول‌های بنیادی، ایمونولوژی، توکسیکولوژی، جست‌وجوی بیومارکرها و تایید آن‌ها و آنالیز فنوتیپی نمونه‌های سلولی و بافتی ارزشمند باشد.

qPCR array
تصویر ۲. این PCR array متشکل از ۹۶ چاهک است و هر کدام از چاهک‌ها بیان ژنی را می‌سنجند که مرتبط با مسیر و یا بیماری خاصی است. همچنین ۵ ژن housekeeping نیز در این array موجود هستند. چاهک‌های H6 تا H12 محتوی کنترل‌هایی برای مانیتورینگ آلودگی DNA ژنومی و نیز first strand synthesis (RTC) و بررسی کارایی PCR می‌باشند.

فرایند RT² Profiler PCR Array از مرحله آماده‌سازی نمونه تا آنالیز داده‌ها دارای ۴ جزء است که ضمانت‌کننده کیفیت بالا، قابلیت بازتولید و حصول داده‌های قابل اطمینان می‌باشند. این مراحل در تصویر زیر به خوبی نمایش داده شده‌اند.

qPCR array
تصویر ۳. فرایند RT² Profiler PCR Array؛ هر PCR array حاوی ۸۹ مجموعه پرایمری qPCR (به همراه ۵ ژن رفرنس) و پنلی به منظور کنترل است. RT2 SYBR Green Master Mix بافری با فرمولاسیونی منحصربه‌فرد است که همراه با الگوریتم طراحی پرایمر تکامل یافته و کارایی بالای واکنش تکثیر را سبب می‌شود. RT2 dirst strand synthesis kit نوعی کنترل خارجی PCR است که توسط PCR arrayها بررسی شده و کیفیت RNA ورودی را می‌سنجد.

زهره محمدی


نمایش دیدگاه ها (0)
دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *