معرفی تکنیک PNA-PCR clamping

نوکلئیک‌اسیدهای پپتیدی (peptide nucleic acids) که به اختصار PNA نامیده می‌شوند، مولکول‌های سنتزشده‌ای از DNA هستند که به جای ستون قند-فسفاتی، از پلیمر پپتیدی کاذبی تشکیل شده‌اند. الیگومرهای PNA به عنوان پروب‌های هیبریداسیون به کار رفته و برای شناسایی مقادیر اندک DNA موجود در نمونه‌های بالینی توسعه یافته‌اند. تکنیک PNA-PCR یا PCR clamping متدی به منظور تکثیر انتخابی توالی‌های هدفی است که ممکن است تنها در یک جفت نوکلئوتید با یکدیگر تفاوت داشته باشند. این متد از اختصاصیت و میل ترکیبی بالای PNA ها نسبت به نوکلئیک‌اسیدهای مکمل خود به این منظور بهره می‌گیرد. PNAها نمی‌توانند به عنوان پرایمری برای DNA پلیمرازها عمل کنند.

PNA چیست؟

PNAها مولکول‌هایی سنتز شده هستند که مقلد DNA می‌باشند. این مولکول‌ها آنالوگ‌هایی از مولکول DNA با اختصاصیت و میل پیوندی بالا بوده و فاقد قابلیت گسترش می‌باشند. PNAها کلاس منحصربه‌فردی از الیگومرهای کایمریک هستند و در آن‌ها ستون دئوکسی‌ریبوز فسفاتی توسط پلیمر پپتیدی کاذبی (pseudo-peptide) جایگزین می‌شود. این پلیمر متشکل از واحدهای ۲-aminoethyl glycine ای است که توسط پیوندهای آمیدی به یکدیگر متصل شده‌اند. بازهای هسته‌ای به ستون پلیمری متصل بوده و از سطح آن برجسته شده‌اند. PNAها با اختصاصیت و میل ترکیبی بالایی به مولکول‌های DNA یا RNA مکمل اتصال می‌یابند. از علل اصلی این موضوع، ستون بدون بار و منعطف پلی‌آمیدی آن‌ها است. الیگومر PNA در حالت اتصال‌نیافته خود، دارای تاخوردگی شدیدی است و درنتیجه نیازی به وجود stemای برای تسهیل quenching نخواهد داشت. خصوصیات منحصر به فرد فیزیکی-شیمیایی PNAها منجر به توسعه انواع فراوانی از تست‌ها شده است.

کاربردهای PNA

در سال‌های اخیر نیز، قدرت استفاده از PNAها در فرایندهای بیولوژی مولکولی و تست‌های تشخیصی آشکار گشته است. از کاربردهای PNA، استفاده از آن به عنوان پروب‌های مولکولی هیبریداسیون است. در نتیجه، متدهای حساس و قدرتمند مبتنی بر PNA فراوانی به منظور توسعه داروهای ضد سرطان و ضد ژن‌هایی خاص، تنظیم واکنش‌های PCR، تشخیص جهش‌های ژنومی و لیبل کردن کروموزوم به صورت in situ.

PNAها می‌توانند به عنوان پروب‌های شناساگر در فرایند qPCR به کار روند. الیگونوکلئوتیدهای PNA متشکل از ستونی شبه پپتیدی حاوی نوکلئوبازها هستند. آنزیم‌هایی مانند نوکلئازها و پلیمرازها نمی‌توانند نوکلئوتیدهای PNA را شناسایی کنند. درنتیجه، این مولکول‌ها بسیار پایدار هستند، اما تنها می‌توانند به عنوان پروب استفاده شوند. ستون شبه پپتیدی و بدون بار PNA، باعث میل ترکیبی بالای آن با هر دو نوع مولکول‌های DNA و RNA می‌شود. علت این موضوع، حداقل بودن دافعه الکتریکی در حین هیبریداسیون است.

سنتز چنین پروب‌هایی، متفاوت با فرایند سنتز الیگونوکلئوتیدهای  DNAاست. پروب‌های PNA حلالیت محدودی در سیستم‌های آبی دارند. در نتیجه، باید به مواردی همچون طراحی توالی، تغییرات افزایش‌دهنده حلالیت و شرایط تست دقت فراوانی نمود. برخی کمپانی‌ها مانند AdvanDX، PNAهایی را به منظور تست‌های تشخیصی تهیه می‌کنند که می توانند در مواردی همچون تشخیص سریع عفونت‌های باکتریایی و مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی احتمالی به کار روند. پروب‌های خطی PNA به منظور انجام تکنیک real-time PCR توسعه پیدا کرده‌اند و مزیت آن‌ها برای این تکنیک، بهبود کینتیک واکنش، اختصاصیت بالاتر و فراهم شدن امکان استفاده از پروب‌هایی با طول بسیار کوتاه‌تر از بیکون‌های مولکولی است.

تکنیک PNA-PCR clamping

متدهایی که باعث شوند تشخیص جهش‌های تک جفت‌‌بازی در DNA تسهیل شود، اهمیت فراوانی در تست‌های تشخیصی DNA و حیطه جدید فارماکوژنتیک دارند. صنعت پزشکی تشخیصی در حال جست‌وجوی متدهایی است که با ترکیب مراحل تکثیری و تشخیصی در سیستمی بسته، از مسائل مربوط به آلودگی DNA جلوگیری نماید. درنتیجه متدهای تشخیص جهش‌ها باید با این پلت‌فرم‌ها هماهنگ باشند.

PCR clamping با هدف‌ قرار دادن مرحله اولیه‌ای که باعث تکثیر غیراختصاصی می‌شود، اختصاصیت واکنش PCR را افزایش می‌دهد. این مرحله، عبارت است از اتصال پرایمر به توالی هدف دارای mismatch. رقابت بین PNA (که مکمل توالی هدف وایلدتایپ است) و یکی از پرایمرهای PCR (که مکمل توالی هدف موتانت است) بر سر جایگاهی مشترک، اساس عملکرد این متد می‌باشد. اگر توالی الگو حاوی توالی وایلدتایپ باشد، اتصال PNA به علت میل ترکیبی بالای PNA منطبق‌شده بر توالی هدف، بر اتصال پرایمر غالب خواهد بود. از آن‌جایی که PNA نمی‌تواند توسط Taq پلیمراز گسترش داده شود، واکنش تکثیری مختل خواهد شد. در صورتیکه توالی موتانت در نمونه حاضر باشد، اتصال پرایمر PCR بر اتصال PNA غلبه کرده و امپلیکون تکثیر خواهد شد.

در PCR clamping مبتنی بر PNA، الیگومرهای PNA باعث می‌شوند که تکثیر توالی مکملی که توسط یک جفت پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی DNA محصور شده‌اند، محدود شود. علت این موضوع آن است که PNAها سوبسترایی برای DNA پلیمراز نیستند. این تست، حساسیتی بالاتر از توالی‌یابی مستقیم داشته و قادر به شناسایی جهش‌ها در نمونه‌هایی حاوی کمتر از یک درصد از الل‌های جهش‌یافته می‌باشد.

یکی دیگر از عملکردهای PCR calmping، تداخل با افزایش طول (elongation) پرایمر است. در یکی از setupها، PNA با فاصله از پرایمر PCR قرار گرفته است و نحوه عمل clamping، توقف elongation است. در دیگری، PNA در مجاورت یکی از پریمرهای PCR قرار می‌گیرد و با جلوگیری از آغاز elongation پرایمر عمل می کند. برای اینکه واکنش clamping عملکرد موثری داشه باشد، PNA باید پیش از پرایمر به توالی کاملا مکمل خود اتصال یابد. مهم‌ترین متغیرهایی که افزوده‌شدن الیگوها با این ترتیب را تحت تاثیر قرار می‌دهد، T_m در حالت اتصال PNA و DNA به توالی‌های هدف، غلظت PNA و پرایمر DNA و کینتیک هیبریداسیون PNA و DNA است. برای کاهش تاثیرات غلظت PNA و کینتیک واکنش، محققان واکنش ۳ مرحله‌ای PCR را به همراه مرحله اتصال، در دمایی به انجام رساندند که تنها PNAای که کاملا مکمل باشد، بتواند به جایگاه هدف خود متصل گردد.

یکی از مهم‌ترین جنبه‌های متد clamping آن است که بلاک کامل تمامی جایگاه‌های هدف در هر چرخه، حتما به منظور دستیابی به موثرترین عملکرد ضروری نیست. در سیستمی که در تصویر ۱ نشان داده شده است،‌ یکی از پرایمرهای PCR در معرض clamping قرار گرفته است، اما دیگری نه. محاسبات نشان داده‌اند که این مورد تاثیر چندانی بر نتیجه واکنش نخواهد گذاشت.

با استفاده از این متد، محققان توانسته‌اند جهش‌های نقطه‌ای c-Kit را از طریق نمونه‌های بیوپسی پوستی تهیه شده از بیماران مبتلا به urticaria pigmentosa شناسایی کنند. این تکنیک برای جست‌وجوی جهش‌های K-Ras در انواع مختلف تومور نیز به کار رفته است. متد PNA-PCR clamping قادر است به سرعت جهش‌های K-Ras را با به‌کارگیری مقادیر اندک DNA شناسایی نماید. استفاده از پروب‌های هیبریداسیون لیبل‌شده با مواد فلورسنت، امکان تشخیص سریع تمام جهش‌های K-Ras را با حساسیت بالایی فراهم می‌کند.

تنها یک جفت پرایمر و یک جفت پروب برای شناسایی تمام جهش‌های ممکن موجود در کدون‌های ۱۲ و ۱۳ ژن K-Ras کافی است. سیگنال فلورسنت شناسایی شده، منطبق بر DNA جهش‌یافته است و می‌تواند با آنالیز منحنی ذوب، تشخیص داده شود. محصولات PNA-PCR قادر هستند که با دقت بالایی نوکلئوتید جهش‌یافته را تشخیص دهند. تمام این مزایا باعث می‌شوند که فرایند دستکاری ژنومی آسان‌تر گردد.