Massively parallel pyrosequencing در سال ۲۰۰۵ توسط شرکت ۴۵۴ Life Sciences توسعه یافت و توسط Roche تجاری‌سازی شد. این تکنیک، توالی یابی ۴۵۴ نام دارد و نخستین تکنیک از توالی یابی‌های نسل جدید است. توالی یابی ۴۵۴ می‌تواند بیش از یک میلیارد باز DNA را در یک روز تعیین توالی کند (معادل یک سوم ژنوم انسان). اولین گام در این تکنولوژي، آماده‌سازی DNA به منظور تکثیر توسط PCR است. در واقع این تکنیک‌ها به جای این که از محصولات PCR یا توالی‌های کلون‌شده استفاده کنند، کار خود را با DNA ژنومی آغاز می‌نمایند. DNA ژنومی طبق پروتکل استاندارد استخراج DNA، از ارگانیسم موردنظر استخراج و سپس DNA خالص با استفاده از هموژنایزر اولتراسونیک (طی فرایند sonication) (و یا با استفاده از آنزیم‌های محدودکننده)، به قطعات کوچکتری با اندازه ۳۰۰ تا ۵۰۰ جفت‌باز تقسیم می‌شود.
مقالات مرتبط:
به منظور تکثیر هر کدام از قطعات، انتهایشان باید دارای توالی شناخته‌شده‌ای باشد و این موضوع خصوصا در ژنوم‌هایی که هرگز توالی یابی نشده‌اند، غیرممکن است. حتی اگر توالی شناخته شده باشد نیز sonication به صورت تصادفی DNA را می‌شکند و راهی برای شناخت دقیق توالی هر کدام از انتهاها وجود ندارد. راه حلی که برای دور زدن این مشکل به کار گرفته می‌شود، استفاده از linker ها یا adaptor ها است که قطعات DNA کوتاهی با توالی شناخته شده می‌باشند. اتصال دو adaptor متفاوت به انتهاهای قطعات DNA صورت می‌گیرد و پس از دناتوراسیون، مولکول‌های تک‌رشته‌ای دارای adaptorهای متفاوت در دو انتها، گزینش می‌شوند. Adaptor ها دو وظیفه بر عهده دارند: نخست اینکه باعث اتصال قطعات به bead ها می‌شوند و دوم اینکه به عنوان مکانی برای اتصال پرایمر عمل می‌کنند. درنتیجه پرایمر یکسانی برای تمام قطعات می‌تواند استفاده شود.
مرحله بعدی، اتصال مولکول‌های انتخاب شده به bead ها است و با استفاده از مکانیسم استرپتاویدین-بیوتین انجام می‌پذیرد. پروتئین باکتریایی استرپتاویدین تمایل اتصال بالایی به ویتامین بیوتین دارد و با طراحی یکی از دو adaptor به نحوی که در انتهای ۵’ خود دارای تگ بیوتین باشد، مولکول‌های DNA به bead های پوشیده شده با استرپتاویدین متصل خواهند شد. به این نحو مولکول‌های الگوی تک‌رشته‌ای DNA روی beadها ثابت می‌شوند و بعدا قطعات تولیدشده طی PCR نیز به سطح آن متصل خواهند شد.
جداسازی bead ها از یکدیگر با تشکیل امولسیون روغن در آب انجام می‌گیرد، طوری که هر قطره حاوی یک bead و واکنش‌دهنده‌های لازم برای PCR (دئوکسی نوکلئوتیدهای آزاد، پرایمرهای مکمل adaptor و Taq پلیمراز) باشد. این موضوع در این تکنیک بسیار حیاتی است. این قطره‌ها microreactor نام دارند. وجود امولسیون، مانع از پراکنده شدن مولکول‌های DNA و واکنش‌دهنده‌ها از یک bead به سایر beadها می‌گردد.
پس از اتمام PCR، حدود ده میلیون نسخه از هر قطعه DNA به صورت ثابت‌شده بر روی هر bead وجود خواهد داشت. در مرحله بعدی امولسیون از هم پاشیده می‌شود و beadها در چاه‌های picoliter که روی یک اسلاید قرار دارند، رسوب داده می‌شوند، به نحوی که هر چاه حاوی یک bead باشد. سطح تحتانی چاه‌ها شفاف است و نور تولید شده می‌تواند از آن عبور کرده و توسط دستگاه شناسایی شود.
چاه‌ها سپس با bead های کوتاه‌تری که سطحشان دارای ATP سولفوریلاز و لوسیفراز است، پوشانده می‌شوند. پیش‌سازهای dNTP یک‌به‌یک و با ترتیب مشخصی (T، سپس A، سپس C، سپس G) به bead ها افزوده می‌شوند و همزمان با تکثیر، خوانش توالی‌ها صورت می‌گیرد (sequencing by synthesis)؛ به این نحو که با هر بار اتصال نوکلئوتید درست، نور نشرشده در تمام واکنش‌ها شناسایی و ضبط می‌گردد. شدت نور تولیدشده منطبق بر تعداد نوکلئوتیدهایی از یک نوع است که به رشته الگو متصل شده‌اند. به عنوان مثال شدت نوری که در اثر اتصال سه باز A ایجاد می‌شود، سه برابر حالتی است که یک باز A وجود دارد.
تکنیک Massively parallel sequencing شرکت ۴۵۴ Life Sciences، در هر واکنش توالی یابی، توالی‌های نسبتا بلندی را می‌خواند و به علاوه هزاران عدد از چنین واکنش‌هایی را به طور موازی انجام می‌دهد. در نتیجه محصول نهایی حدود ۱۰هزار بار بزرگتر از توالی یابی دی دئوکسی می‌گردد. البته ایراداتی نیز در این تکنیک وجود دارد؛ از جمله اینکه تشخیص تعداد بازها در حالتی که چندین باز تکراری به دنبال هم می‌آیند (مثلا AAAAAA) دشوار است.
مقاله مرتبط: تکنیک توالی یابی Illumina
