معرفی تکنیک Polymerase Cycling Assembly

پیشرفت سریع بیولوژی سنتتیک، باعث افزایش روزافزون نیاز به تولید ژن‌های سنتتیک شده است. سنتز ژن به صورت de novo، امکان تولید مولکول‌های DNA موردنظر را فراهم می‌کند، بدون اینکه خبری از محدودیت‌های موجود در تکنیک‌های cloning assembly قدیمی باشد؛ مانند اسکارها، غیرمنطبق بودن جایگاه تشخیص آنزیم محدودکننده، دشواری جمع‌آوری کل قطعات موردنظر در کنار یکدیگر، قرار گرفتن قطعات در ترکیب نادرست و زمانبر بودن.

مقالات مرتبط:

• هر آن‌چه باید در مورد PCR بدانید!
• تکنیک Real-time PCR
• معرفی تکنیک Methylation-specific PCR

امروزه می‌توان به آسانی توسط نرم‌افزارهایی مولکول DNA موردنظر را طراحی کرد، اما چالش اساسی این فیلد، تولید مولکول‌های طراحی شده به صورت فیزیکی است. یکی از متدهایی که به منظور DNA assembly وجود دارد، polymerase chain assembly (PCA) است. PCA یا assembly PCR نوعی از PCR است که هدف از آن سوار کردن الیگونوکلئوتیدهای دارای همپوشانی توالی روی همدیگر است، به طوری که به عنوان مثال، به ژن‌هایی کامل تبدیل شوند و یا بتوان آن ها را راحت‌تر کلون کرد. این تکنیک برای نخستین بار در سال ۱۹۹۵ ارائه شدو در سال ۲۰۰۲، توسعه بیشتری یافت.

بیولوژی سنتتیک کاربردهای وسیعی در طراحی و مهندسی انواع مختلفی از سیستم‌های بیولوژیکی در سطوح مختلف مانند مهندسی بیومولکولی، مدارهای ژنی و طراحی شبکه؟ (network design)، مهندسی متابولیک و سنتز کل یک کروموزوم و حتی کل ژنوم دارد. توانایی سنتز توالی‌های DNA همچنین ابزار مولکولی قدرتمندی را به منظور ویرایش ژن، تعیین عملکرد ژن‌ها و مطالعه ارتباط میان ساختار و عملکرد پروتئین‌ها فراهم می‌آورد.

به منظور حصول به این اهداف، توانایی سنتز سریع و de novo ساختارهای DNA با هر توالی و اندازه‌ای، با دقت و صرفه اقتصادی بالا، بسیار حیاتی می‌باشد. امروزه فرایند سنتز الیگونوکلئوتیدهای DNA به میزان زیادی ماشینی شده و متدهایی که قطعات بلندتر DNA را با اتصال قطعات پیش‌ساخته، سنتز می‌کنند در حال توسعه هستند. پیشرفت‌های اخیر حوزه سنتز شیمیایی DNA، ساخت و کنار هم قرار دادن ژن‌ها را به منظور حصول به عملکردهای جدیدتر و پیشرفته‌تر فراهم کرده‌اند. در بسیاری از موارد، کاربرد مورد نظر، ویرایش توالی‌های کدکننده به منظور افزایش میزان بیان آن‌ها و نیز افزایش پایداری پروتئین‌های ساخته‌شده است.

تولید ترکیبات حیاتی به صورت شیمیایی از مدت‌ها پیش موردعلاقه بشر بوده و امروزه با آگاهی از نقش ژنتیکی DNA، تمرکز محققان بیشتر روی سنتز الیگونوکلئوتیدها و ژن‌ها منعطف شده است. سنتز ژن ۲۰۷ جفت‌بازی tRNA مهارکننده تیروزین در سال ۱۹۷۹ توسط Khorana و همکارانش گام بزرگی در این مسیر بود. از آن زمان تاکنون متدلوژی سنتز DNA به آهستگی پیشرفت کرده است و روش‌های کنونی بر پایه کنار هم قرار دادن آنزیمی الیگونوکلئوتیدهای سنتزشده به صورت شیمیایی انجام می شوند. یکی از پرکاربردترین این متدها PCA است و علت به‌کارگیری فراوان این تکنیک، سادگی آن می‌باشد.

PCA نخستین بار به منظور تولید ژن HIV-2 Rev که طولی به اندازه ۳۰۳ جفت‌باز داشت استفاده شد و امروزه می‌تواند ژن‌هایی که بزرگتر از یک کیلوباز هستند را نیز سنتز کند. در سال ۱۹۹۵، Stemmer و همکارانش از واکنش چرخه‌ای پلیمراز یک مرحله‌ای به منظور کنار هم قرار دادن مجموعه‌ای از الیگونوکلئوتیدها و تولید پلاسمیدی ۲.۷ کیلوبازی استفاده کردند که قابل تکثیر در E. coli بود. پیش‌بینی‌ها حاکی از آن است که تکنولوژی سنتز DNA قادر خواهد بود ژنوم‌هایی کوچک را نیز تولید کند.

واکنش PCA نوعی واکنش چرخه حرارتی پلیمراز و مشابه PCR است، با این تفاوت که پرایمرها در غلظت‌های بالاتری نسبت به توالی‌های الگو حضور ندارند. همچنین PCA از مولکول‌های الگوی تک‌رشته‌ای به عنوان الگو استفاده می‌کند و وظیفه آن همانندسازی هر دو رشته DNA نیست.

طی فرایند PCA، ابتدا الیگونوکلئوتیدهای کوتاه‌تر که که طولی به اندازه ۴۰ نوکلئوتید دارند، سنتز می‌شوند؛ به نحوی که پس از قرار گرفتن در کنار یکدیگر، در ۲۰ الی ۳۰ نوکلئوتید با یکدیگر هم‌پوشانی داشته باشند. فرایند کلونینگ PCR شامل تکثیر قطعات توسط پرایمرهای forward و reverse و سپس اتصال قطعات در اثر تجزیه توسط آنزیم محدودکننده است. اما در PCA، پرایمرها از ابتدا به گونه‌ای طراحی می‌شوند که محصولات الیگونوکلئوتیدی PCR با قطعه مجاور، در هر دو طرف، دارای هم‌پوشانی باشند.

در مرحله بعدی، ژن‌ها assembly شده و به یکدیگر متصل می‌شوند. این فرایند از DNA لیگاز استفاده نمی‌کند. البته نوعی از این تکنیک نیز وجود دارد که با ترکیب ligation نوکلئیک‌اسیدها و PCA انجام می‌شود. به منظور پر شدن گپ‌های میان نواحی متصل‌شده به یکدیگر در اثر هم‌پوشانی، از پلیمراز و dNTPها کمک گرفته می‌شود؛ به این نحو که پلیمراز با استفاده از بازهای مکمل رشته مقابل جاهای خالی را پر می‌کند.

کنار هم قرار گرفتن ژن‌ها فرایندی است که قدم به قدم انجام می‌شود. الیگوهای دارای هم‌پوشانی از انتها به یکدیگر متصل شده و هر کدام دایمرهای متمایزی را تشکیل می‌دهند. هر کدام از دو ناحیه تک‌رشته‌ای به عنوان الگو عمل کرده و الیگوی مکمل را با عمل پلیمراز همانندسازی می‌کنند، تا اینکه DNA دورشته‌ای تشکیل شود. این مولکول، بخش کوچکی از ژن نهایی را تشکیل خواهد داد.

در طی چرخه‌های بعدی PCA، هر کدام از قطعات دورشته‌ای DNA دناتوره شده و انتهاهای دارای هم‌پوشانی مجددا به همدیگر متصل می‌شوند. با اتصال انتهاهای مکمل ۳’ به یکدیگر، رشته مقابل به عنوان توالی الگو مورد استفاده قرار گرفته، هر دو رشته گسترش می‌یابند و مولکول دورشته‌ای حاصل می‌شود. رشته‌های DNA به بلندتر شدن ادامه می‌دهند، تا زمانیکه full-length شوند و نتوان آن‌ها را بیشتر گسترش داد. مرحله نهایی، انجام واکنش PCR به صورت جداگانه است که ژن ساخته شده را تکثیر می‌کند، کاری که PCA قادر به انجام آن نبود.

پس با استفاده از PCA می‌توان قطعات بسیاری را در یک بار واکنش به یکدیگر متصل کرده و محصولی نهایی به طول چند هزار جفت‌باز به دست آورد، بی‌آنکه نیازی به استفاده از آنزیم محدودکننده باشد و حتی ژن و یا ژنومی سنتتیک تهیه کنیم، بدون اینکه هیچ‌گونه اسکاری در محصول نهایی برجای بماند. باید در نظر داشت که PCA واکنش تکثیری نیست و تعداد مولکول‌های full-length همانندسازی شده در پایان واکنش محدود خواهد بود. از آن‌جایی که پلیمراز مورداستفاده فاقد خاصیت اگزونوکلئازی ۵’ به ۳’ است، هیچ مولکول DNAای تجزیه نمی‌گردد.

در این حالت، ترکیب‌های متنوعی از دایمرها می‌توانند به یکدیگر متصل شوند و همه آن‌ها منتهی به گسترش موفقیت‌آمیز الیگوها نخواهند شد. پلیمرازها، گسترش رشته‌ها را تنها در جهت ۵’ به ۳’ انجام می‌دهند. پس با وجود اینکه دایمرهای الیگوی بسیاری در اثر همپوشانی به یکدیگر متصل می‌شوند، تنها آن‌هایی همانندسازی خواهند شد که پتانسیل گسترش از سمت ۵’ به ۳’ را داشته باشند. پس، الیگوهای انتهایی باید ژن‌هایی با سر پایانی ۵’ را گسترش دهند. در صورت قرارگیری الیگوی انتهایی روی رشته‌ای با انتهای ۳’، گشترش الیگوی مکمل باید از سمت ۳’ به ۵’ صورت بگیرد تا گپ‌ها پر شوند و این موضوع در متدلوژی استاندارد پلیمراز ممکن نیست.

توالی‌یابی به منظور حصول اطمینان از دقت فرایند انجام می‌گیرد. دیگر تکنیک‌های انتخاب توالی سنتز شده به شیوه درست، عبارتند از: هیبریداسیون حساس به mismatch و برش آنزیمی mismatch و پروتئین متصل‌شونده به mismatch که به منظور حذف DNAهای دارای خطا در توالی به کار می‌رود. این قطعات بلند DNA به داخل وکتور پلاسمیدی الحاق می‌شوند تا در آینده مورداستفاده قرار گیرند.

پروتکل اصلی PCA دارای یک و یا دو مرحله است

در فرایند دومرحله‌ای، همان‌طور که توضیح داده شد، الیگونوکلئوتیدهای دارای همپوشانی که به همراه یکدیگر، کل توالی را می‌سازند، در غلظت‌های مساوی و پایین با مخلوط PCR ترکیب می‌شوند. این مخلوط شامل بافر، dNTPها و پلیمراز است. مراحل مختلف چرخه حرارتی مشابه PCR استاندارد تنظیم می‌گردند.

هدف از مرحله اول، کنار هم قرار دادن قطعات در کنار یکدیگر و گسترش آن‌هاست، به نحوی که در نهایت قطعه‌ای با طول حداکثر یک کیلوباز تهیه شود. این قطعات پس از اتصال از یکدیگر به عنوان توالی الگو استفاده می‌کنند تا در هر بار قطعات بلندتری حاصل آید. تا اینکه درنهایت قطعه‌ای با طول موردنظر حاصل می‌شود. سپس واکنش PCR دیگری از جفت پرایمرهایی استفاده می‌کند که منطبق بر انتهای ژن تولیدشده هستند. در این حالت، مقادیر اندکی از مخلوط واکنش assembly به عنوان الگو افزوده می‌شود تا محصول کامل تکثیر شود.

در واکنش تک‌مرحله‌ای، یک جفت پرایمر gene-end از ابتدا با غلظتی بالاتر از الیگونوکلئوتیدهای سازنده ژن، به واکنش افزوده می‌شود. احتمالا برای جمع‌آوری و تکثیر قطعات و در نهایت تولید قطعه کامل، به چرخه‌های بیشتری نیاز داشته باشیم. این استراتژی در فرمت مالتیپلکس نیز انجام می‌شود تا چندین ژن را در یک واکنش کنار یکدیگر قرار دهد. پس از طراحی قطعات الیگونوکلئوتیدی کوتاهی که با همسایگانشان دارای همپوشانی هستند، واکنش assembly همانند PCR عادی راه‌اندازی می‌گردد و در این حالت نیز، توالی الگو مخلوطی از الیگونوکلئوتیدهای دارای همپوشانی است.