در بسیاری از آزمایش‌های PCR، نمونه‌ای که باید تکثیر شود از جنس DNA نیست؛ مثلا در مواردی که عفونت با ویروس‌های RNAدار اتفاق افتاده باشد. در این حالت تکنیک RT-PCR به کار می‌رود. RT-PCR نوعی از PCR است که از mRNA به جای DNA به عنوان الگوی شروع واکنش تکثیر in vitro نوکلئیک‌اسیدها استفاده می‌کند. کاربرد اصلی این واکنش مطالعه رونویسی ژن موردنظر است و توانایی آنزیم رونوشت‌بردار معکوس (reverse transcriptase) را به این منظور به کار می‌گیرد. این آنزیم در اوایل دهه ۱۹۷۰ از رتروویروس‌ها استخراج شد و در نهایت انجام این نوع از PCR را ممکن ساخت.
Reverse transcriptase یک DNA پلیمراز وابسته به RNA است و سنتز DNA با استفاده از الگوی RNA را کاتالیز می‌کند. در حقیقت RT-PCR ترکیب دو واکنش رونوشت‌برداری معکوس (reverse transcription) و PCR عادی است. DNA تک‌رشته‌ای حاصل از این واکنش که cDNA (complementary DNA= DNA مکمل) نامیده می‌شود، به عنوان الگویی برای PCR عادی عمل می‌کند. cDNA حاصل توسط RNase تجزیه نمی‌شود و درنتیجه پایدارتر از RNA می‌باشد. علاوه بر آن، به علت استفاده از mRNAها به عنوان الگو، تنها تکثیر نواحی کدکننده DNA (اگزون‌ها) انجام گرفته و از تکثیر نواحی غیرکدکننده (اینترون‌ها) جلوگیری به عمل می‌آید.
در طول فرایند RT-PCR، RNAهای آغازگر واکنش تجزیه می‌شوند و DNA های دورشته‌ای تولیدشده واکنش PCR عادی را ادامه می‌دهند. RT-PCR می‌تواند به صورت دو واکنش جداگانه و یا یک واکنش واحد انجام گیرد که مورد آخر با استفاده از کیت‌هایی که به صورت تجاری و با آنزیم‌هایی اختصاصی‌تر تهیه شده‌اند، عملی می‌شود. مزیت RT-PCR در حساسیت آن است؛ این واکنش به مقادیر نسبتا کمی از نمونه اولیه نیاز دارد و می‌تواند بیان ژن را حتی در یک سلول واحد بررسی کند.
مقاله مرتبط: PCR چیست؟
تجهیزات و مواد مورد نیاز RT-PCR
برخی از تجهیزات و مواد اولیه مورد استفاده در RT-PCR عبارتند از: ترموسایکلر PCR (PCR thermocycler)،دستگاه الکتروفورز در ژل آگارز، پرایمرها، dNTPها، آنزیم Reverse transcriptase، Taq DNA پلیمراز، بافر PCR و بافر RT.
پرایمرهای مورد استفاده در RT-PCR می‌توانند به این شکل ها باشند: ۱. پرایمرهای هگزامر تصادفی، ۲. Oligo-dTها و ۳. پرایمرهای اختصاصی برای توالی موردنظر. نوع اول امروزه با توجه به شناخته‌شدن توالی اکثر ژنوم‌ها کاربرد چندانی ندارد. پرایمرهای نوع دوم، مکمل دم poly-A موجود در mRNAها هستند و با اتصال به آن واکنش را آغاز می‌کنند. پرایمرهای نوع سوم که برای نقاط شناخته‌شده‌ای از mRNAها طراحی می‌شوند، باعث بهینه‌سازی واکنش برای توالی دلخواه می‌گردند و در کلون کردن کاربرد دارند.
مقاله مرتبط: مهندسی ژنتیک چیست؟
مراحل انجام RT-PCR:
- مرحله آماده‌سازی:
در این مرحله استخراج کل RNA موجود در نمونه مورد نظر انجام می‌گیرد. پرایمرها نیز برای ژنی که قرار است تکثیر شود، طراحی و سفارش داده می‌شوند. کیت‌های آماده‌ای برای استخراج RNAها وجود دارند که با ترکیب شدن با RT-PCR باعث می‌شوند که آنالیز RNA نیز در آزمایشگاه‌های بالینی به حساسیت و سرعت تکثیر DNA با استفاده از PCR شود.
- گام اول: بازکردن RNAها؛
در این مرحله با افزایش دما تا ۶۵ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه، ساختارهای ثانویه و پیچ‌و‌تاب‌های RNAهای موجود در نمونه از همدیگر باز می‌شوند.
- گام دوم: واکنش Reverse transcriptase؛
در این مرحله آنزیم Reverse transcriptase برای سنتز DNA از mRNA مورد استفاده قرار می‌گیرد؛ در واقع آنزیم Reverse transcriptase از mRNAها به عنوان الگویی برای تولید قطعات DNA تک‌رشته‌ای موسوم به cDNA استفاده می‌کند. آنزیم Reverse transcriptase مرود استفاده در واکنش دارای سه ویژگی اساسی است: ۱. سنتز DNA را با استفاده از الگوی RNA انجام می‌دهد؛ ۲. رشته RNA را از رشته DNA جدا می‌کند (RNase H activity)؛ ۳. رشته DNA دوم را بر روی DNA الگو سنتز می‌کند.
طی این فرایند، RNAهای دناتوره شده در اثر حرارت، بافر RT، dNTPها، پرایمرها، آنزیم Reverse transcriptase به همراه سایر مواد موردنیاز در لوله PCR قرار داده شده و به مدت یک ساعت و در دمای ۴۲-۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه می‌شوند. DNAهای تک‌رشته‌ای حاصل از این واکنش به مدت ۲ دقیقه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد حرارت داده می‌شوند تا دناتوره شوند.
در این مرحله نباید DNA ژنومی در داخل نمونه موجود باشد. برای مطمئن شدن از این موضوع از کنترل منفی استفاده می‌شود؛ به این صورت که آنزیم Reverse transcriptase اصلا اضافه نمی‌شود. در این حالت تولید محصولات PCR دال بر آلودگی نمونه با DNA می‌باشد. اگر این مشکل ادامه یابد، محلول باید پیش از شروع واکنش در معرض آنزیم DNase قرار بگیرد.
- گام سوم: واکنش PCR؛
در این مرحله واکنش PCR طبق روال عادی انجام می‌گیرد و طی آن cDNAها تکثیر می‌شوند تا برای مطالعه بیشتر مورد استفاده قرار گیرند. از جمله مواد مورد استفاده در این واکنش cDNAها، بافر PCR، پرایمرهای forward و reverse، dNTPها وآنزیم‌های Taq DNA پلیمرازهستند که در داخل لوله PCR و در داخل دستگاه ترموسایکلر قرار داده می‌شوند و به مدت ۳۰ ثانیه و در دمای ۹۸ درجه سانتیگراد حرارت داده می‌شوند. این چرخه ۲۰ الی ۳۰ بار تکرار می‌شود.
- گام چهارم: آنالیز محصولات؛
هنگامی که تکثیر قطعات مشخصی از RNA صورت می‌گیرد، محصولات باید الکتروفورز شده و از لحاظ وجود یا عدم وجود، میزان و سایز نوارها مورد بررسی قرار گیرند.
کاربرد تکنیک RT-PCR
ارزش تکنیک RT-PCR در توانایی آن برای تعیین وجود یا عدم وجود یک نوع mRNA خاص در نمونه است. همچنین می‌تواند برای کلون کردن cDNA به منظور انجام مطالعات بعدی خصوصا در ژن‌هایی که اطلاعات اندکی در موردشان داریم، استفاده شود. RT-PCR معمولا برای بررسی بیماری‌های ژنتیکی و نیز بیان ژن در انواع مختلف بافت‌ها و سلول‌ها به کار می‌رود.
از کاربردهای معمول این تکنیک، تشخیص عفونت‌های ایجادشده توسط ویروس‌های RNAدار مانند HIV و HCV (ویروس هپاتیت C) است. آنالیز رونوشت‌های mRNA مانند آن‌هایی که توسط translocationها ایجاد می‌شوند، نیز توسط RT-PCR انجام می‌شود و با بیماری‌هایی مانند non-Hodgkin’s lymphoma، Leukemia و Sarcoma در ارتباط است. تهیه پروفایل بیان ژن (gene expression profiling) که در سال‌های آتی تاثیری عظیم بر روش‌های تشخیص مولکولی خواهد گذاشت، وابسته به آنالیز RNA است و از RT-PCR کمک می‌گیرد.
عالی بود، بسیار شیوا و به زبان نسبتا ساده توضیح دادین. ممنونم