اساس تکنیک توالی یابی Illumina تکنیک دی دئوکسی است، اما از نوآوری‌های فراوان دیگری نیز بهره برده است. در این تکنیک علی‌رغم پایین بودن تعداد توالی‌های خوانده شده، محصولات بیشتری نسبت به تکنیک توالی یابی ۴۵۴ تولید می‌شود. طی این فرایند، از نوکلئوتیدهای متصل به یک مولکول فلورسنت قابل جداسازی که هر کدام از بازها رنگ متفاوتی دارند و نیز یک ماده شیمیایی خاتمه دهنده زنجیره استفاده می‌شود. به جای نبود گروه ۳’-OH که در توالی یابی در دئوکسی عادی باعث خاتمه زنجیره می‌شود، در این تکنیک نوکلئوتیدها دارای یک گروه شیمیایی هستند که می‌تواند ۳’-OH را بلاک کرده و از ادامه همانندسازی توسط DNA پلیمراز جلوگیری کند. این گروه‌ها را می‌توان به طریق آنزیمی جداسازی کرد.
مقاله مرتبط: توالی یابی نسل جدید
همانند سایر تکنولوژي‌های توالی یابی نسل جدید، اولین گام در این تکنولوژي، آماده‌سازی DNA به منظور تکثیر توسط PCR است. در واقع این تکنیک‌ها به جای این که از محصولات PCR یا توالی‌های کلون‌شده استفاده کنند، کار خود را با DNA ژنومی آغاز می‌نمایند. DNA استخراج شده به قطعات کوچکتری که طولشان در حدود ۲۰۰ تا ۶۰۰ جفت‌باز است، شکسته می‌شود. توالی‌های کوتاهی که adaptor نام دارند، به قطعات DNA متصل می‌گردند. سپس مولکول‌های DNA دناتوره می‌شوند تا تک‌رشته‌ای شوند.
پس از طی این مراحل آماده‌سازی، قطعات DNA به سطح یک فلوسل (flow cell) اتصال می‌یابند و سپس سطح فلوسل شسته می‌شود تا DNAهای متصل نشده در سطح باقی نمانند.(؟؟؟) سطح فلوسل دارای پرایمرهایی است که مکمل adaptorهای متصل شده به سطح می‌باشند. adaptorها و پرایمرها باید به حد کافی از هم دور باشند تا شناساگر موجود در کف فلوسل، آن‌ها را در موقعیت‌های جداگانه‌ای تشخیص دهد.
مشابه توالی یابی ۴۵۴، قطعاتDNA ثابت شده در سطح فلوسل، در اثر انکوبه شدن با DNA پلیمراز و دئوکسی نوکلئوتیدها طی فرایندی به نام bridge sequencing همانندسازی می‌شوند. پرایمرهای موردنیاز برای تکثیر قطعات DNA به فلوسل متصل هستند؛ در نتیجه DNA در اثر اتصال به پرایمر، فرمی پل مانند پیدا می‌کند. این قطعات تکثیر و رهاسازی و سپس به منظور تک‌رشته‌ای شدن دناتوره می‌شوند تا توده‌ای از قطعات DNA مشابه را تشکیل دهند.
فرایند توالی یابی سپس به ترتیب زیر انجام می‌گیرد: چهار نوکلئوتید لیبل شده با رنگ‌های فلورسنت به همراه آنزیم DNA پلیمراز به میلیاردها توده DNA که روی یک اسلاید ثابت شده‌اند، افزوده می‌شوند. در هر توده تنها نوکلئوتیدهای مکمل توالی الگو به صورت کوالانسی متصل و نوکلئوتیدهای متصل نشده شسته می‌شوند. سپس دوربینی دیجیتال با رزلوشن بالا، پس از تابیده شدن لیزر و فعال شدن رنگ‌های فلورسنت، تصویری را ثبت می‌کند که مشخص کننده نوکلئوتیدهای اضافه شده به زنجیره در هر توده است.
لیبل فلورسنت و گروه بلاک‌کننده ۳’-OH به صورت آنزیمی جداسازی می‌شوند و فرایند به دفعات تکرار می‌گردد. به این نحو، میلیاردها واکنش توالی یابی به طور همزمان انجام می‌گیرند. با ردیابی تغییرات رنگ در هر توده، توالی DNA موجود در هر نقطه معین می‌شود. با اینکه هر کدام از توالی‌ها به تنهایی نسبتا کوتاه هستند (حدود ۲۰۰ نوکلئوتید)، میلیاردها عدد از آن‌ها به طور همزمان انجام می‌شوند تا در عرض یک روز، چندین ژنوم انسانی توالی یابی شود. بررسی باز به باز توالی باعث دقت بالای این متد شده است.
مقاله مرتبط: تکنیک توالی یابی ۴۵۴
