معرفی تکنیک overlap extension PCR

Overlap extension PCR یا OE-PCR تکنیکی است که به منظور اتصال یا splicing دو توالی به یکدیگر، مانند اتصال توالی تنظیم‌کننده به توالی کدکننده و نیز اتصال توالی‌های مربوط به دو domain پروتئینی به کار می‌رود. این تکنیک همچنین در افزودن جهش‌های نقطه‌ای و حذف یا الحاق توالی‌های جدید به داخل DNA کاربرد دارد. این تکنیک قادر است بی آنکه نیازی به وجود آنزیم‌های محدودکننده و T4 DNA لیگاز داشته باشد، با سرعت و reliability بالا نسبت به سایر متدها، موارد گفته‌شده را به انجام برساند. در نتیجه با انجام تنها دو واکنش PCR و بدون آنکه مجبور به حل معماهای پیچیده مربوط به آنزیم‌های محدودکننده باشیم، خواهیم توانست قطعه DNAای را وارد یک پلاسمید کرده و یا جهش‌های جدیدی را به داخل توالی موردنظر القا نماییم.

مقالات مرتبط:

• معرفی تکنیک Ligation-mediated PCR
• معرفی تکنیک Methylation-specific PCR
• هر آن‌چه باید در مورد PCR بدانید!
• پرایمرها در PCR

اساس OE-PCR

در صورت استفاده از این تکنیک برای کلونینگ، دو واکنش نخست PCR منجر به تولید قطعه‌ای خطی خواهند شد که حاوی توالی‌هایی مرتبط با مولکول DNA اصلی در دو سمت خود است. درنتیجه رشته‌های تولیدشده در PCR اول به عنوان مگاپرایمرهایی رو توالی اصلی که قصد تغییر آنرا داریم، عمل کرده و طی PCR دوم تکثیر می‌شوند. محصول این واکنش، DNAای حلقوی و حاوی nick می‌باشد. درصورتیکه توالی اصلی یک وکتور مانند پلاسمید باشد، محصول تولیدشده طی واکنش PCR دوم، وکتوری حامل قطعه الحاقی موردنظر خواهد بود.

تصویر ۱. کلیت فرایند کلونینگ با OE-PCR؛ طی واکنش PCR نخست، قطعه الحاقی به نحوی تکثیر می‌شود که در دو سمت خود حاوی توالی‌هایی مربوط به پرایمر باشد. این توالی‌های طی واکنش PCR دوم به عنوان مگاپرایمر عمل کرده و در نهایت پلاسمیدی تولید می‌شود که قطعه موردنظر به داخل آن وارد شده است.

اتصال ژن‌ها به یکدیگر به کمک OE-PCR

تصویر ۲ فرایند OE-PCR را در مورد اتصال دو توالی به همدیگر به صورت شماتیک توصیف کرده است. موضوعی اساسی که در این تکنیک باید مورد توجه قرار بگیرد این است که حداقل یک پرایمر باید حاوی همپوشانی با توالی انتهایی قطعه‌ای باشد که قرار است به آن متصل گردد. طی OE-PCR دو واکنش PCR جداگانه خواهیم داشت که غالبا به صورت همزمان انجام می‌گیرند. مواد موردنیاز واکنش، DNAهای الگو و پرایمرهای مناسب (P1 و P2 برای واکنش نخست و P3 و P4 برای واکنش دوم) هستند. طراحی حداقل یک و گاها دو پرایمر ‘overlap’ (P2 و P3) منجر به تولید دو محصول PCR می‌شود که دارای ناحیه‌ای یکسان در توالی‌های خود می‌باشند. این ناحیه را پرایمرهای overlap تعیین می‌کنند. مقداری از محصولات این دو واکنش نخستین به منظور واکنش PCR دوم به کار می‌روند.

در راندهای اولیه واکنش PCR دوم، محصولات تولیدشده دناتوره شده و به علت وجود هم‌پوشانی به یکدیگر متصل می‌شوند. نتیجه، تولید محصولاتی با انتهای ۳’ است که می‌تواند روی  رشته‌های مکمل گسترش یافته و محصولی با طول کامل را ایجاد کنند که متشکل از دو توالی اتصال یافته است. پس از تشکیل این محصول، پرایمرهای flanking (پرایمرهای P1 و P4 موجود در تصویر ۲) موجب تکثیر نمایی آن خواهند شد. همان‌طور که در این تصویر نمایش داده شده است‌، تنها یکی از رشته‌های هر محصول productive است. این رشته دارای انتهای ۳’ ای است که قادر است به رشته مکمل خود روی محصول دیگر متصل شود. سایر رشته‌هایی که نتوانند به این نحو به توالی مکمل خود متصل شوند، nonproductive بوده و محصولی تولید نخواهند کرد. البته، پرایمرهای P1 و P4 می‌توانند به رشته‌های nonproductive نیز متصل شده و آن‌ها را به صورت خطی تکثیر کنند.

جهش‌زایی به کمک OE-PCR

با استفاده از تکنیک OE-PCR می‌توان جهش‌های جدید را نیز به داخل ساختار DNA القا نمود. دراین مورد توالی الگو برای هر دو واکنش PCR اولیه یکسان خواهد بود. پرایمرهای overlap (P2 و P3) به گونه‌ای طراحی می‌شوند که بتوانند جهش‌های مناسب را القا کنند. درنتیجه، توالی‌های دارای هم‌پوشانی مکمل یکدیگر بوده اما این بار هر دو رشته تغییرات بازی مناسب موردنظر را خواهند داشت. محصول واکنش PCR اول، تولید و تکثیر جداگانه دو قطعه جهش‌یافته و خالص‌سازی آن‌ها است.

در واکنش PCR دوم، محصولات جهش‌یافته حاصل از واکنش اول به یکدیگر متصل شده و self-priming انجام می‌دهند تا بتوانند محصولات کامل و جهش‌یافته را ایجاد کنند. تکثیر این قطعات با پرایمرهای احاطه‌کننده P1 و P4 انجام خواهد گرفت. این محصول بعدا می‌تواند توسط آنزیم محدودکننده مناسب تجزیه شده و در محل مربوطه در پلاسمید وارد می‌گردد. همچنین می‌توان با فرایند Quikchange و استفاده از قطعه تولیدشده به عنوان مگاپرایمر، سنتز پلاسمیدها را انجام داد.

به دنبال سنتز، هضم توسط DpnI و ترانسفورماسیون انجام می‌شود. از inverse PCR نیز می‌توان به این منظور استفاده کرد. OE-PCR بیشتر در مورد توالی‌های خطی به کار می‌رود و نیاز به راندهای متعددی از PCR دارد، اما iPCR برای مولکول‌های الگوی حلقوی مانند وکتورها طراحی شده و پروتکلی ساده دارد که تنها از یک واکنش PCR استفاده می‌کند.

فرایند کلونینگ با OE-PCR

در صورتیکه هدف وارد کردن قطعه DNA مورد نظر به داخل یک پلاسمید و انجام کلونینگ باشد، فرایند OE-PCR شامل مراحل زیر خواهد بود:

1. واکنش PCR نخست: در این مرحله خود قطعه الحاق شونده تولید می‌گردد. این قطعه حاوی توالی پلاسمید در هر دو انتهای خود بوده و درنتیجه می‌تواند بعدا در آن‌ ناحیه با ایجاد هم‌پوشانی، گسترش پیدا کند. PCR در شرایط استاندارد انجام می‌گیرد و محصولات با استفاده از ستون DNA جمع‌آوری می‌شوند. سپس سنجش کمی محصولات انجام می‌شود تا از وجود غلظت کافی آن‌‌ها در مرحله بعدی اطمینان حاصل کنیم. معمولا مقدار DNA موردنیاز بین ۳۰۰ تا ۵۰۰ نانوگرم است.
2. واکنش PCR دوم: محصولات واکنش اول به منظور تکثیر پلاسمید موردنظر به کار گرفته می‌شوند. واکنش PCR دوم با استفاده از پلیمرازی انجام می‌گیرد که درجه procesivity بالایی داشته و فاقد فعالیت strand displacement می‌باشند. طبق مطالعات صورت گرفته، بهترین نتایج زمانی حاصل می‌شوند نسبت غلظت قطعات الحاقی به غلظت پلاسمیدها حدود ۲۵۰:۱ باشد. محصول نهایی پلاسمیدی دو‌رشته‌ای خواهد بود که حاوی دو nick (یک عدد در هر رشته) است.
3. ترانسفورماسیون محصول نهایی: محصول به صورت مستقیم به داخل باکتری‌هایی مناسب مانند coli  انتقال داده شده و آنزیم‌های ترمیم DNA باکتریایی nickها را ترمیم می‌کنند.

Asymmetric OE-PCR

پروتکل اصلی OE-PCR متشکل از دو راند از PCR بوده و نیازمند مراحلی طولانی به منظور خالص‌سازی محصولات راند اول PCR می‌باشد. با ترکیب asymmetric PCR و overlap extension PCR متد asymmetric overlap extension PCR (AOEPCR) حاصل می‌شود. در این تکنیک پس از مخلوط کردن مستقیم محصولات راند نخست PCR، دو واکنش جداگانه asymmetric PCR با حدود ۳۰ چرخه انجام شده و پس از آن، یک چرخه اتصال و گسترش صورت می‌گیرد. AOE-PCR نیاز به مراحل خالص‌سازی و تکثیر توالی الگوی وایلدتایپ را از بین برده و با تعداد چرخه‌های کمتری به انجام می‌رسد؛ در نتیجه در موتاژنز site-directed ابزار سریع‌تر، آسان‌تر و موثرتری نسبت به OE-PCR می‌باشد.

همان‌طور که در تصویر ۵ توضیح داده شده است، این تکنیک متشکل از دو مرحله است: حدود ۳۰ چرخه از asymmetric PCR و یک چرخه از اتصال و گسترش. در مرحله اول، دو قطعه DNA جهش‌یافته طی واکنش‌های PCR جداگانه تکثیر می‌شوند. در طی چرخه‌های اولیه، محصولات دورشته‌ای به صورت نمایی تکثیر می‌گردند. با اتمام پرایمرهای جهش‌یافته که دارای غلظت پایین‌تری هستند، در چرخه‌های پایانی محصولات تکثیری عمدتا مولکول‌هایی تک‌رشته‌ای خواهند بود که توسط پرایمرهای flanking احاطه شده‌اند. درنتیجه، تعداد فراوانی از مولکول‌های تک‌رشته‌ای که دارای هم‌پوشانی در انتهاهای ۳’ خود می‌باشند (ناحیه جهش‌یافته پرایمر)، طی واکنش‌های تکثیری جداگانه‌ای حاصل خواهند شد.

در مرحله دوم، واکنش‌های جداگانه به صورت مستقیم مخلوط می‌شوند، بی ‌آنکه نیاز به انجام مراحلی چون خالص‌سازی باشد. سپس، چرخه‌ دیگری متشکل از مراحل اتصال و گسترش و با استفاده از فعالیت DNA پلیمراز پیشین موجود در واکنش انجام می‌گیرد تا مقادیر کافی از قطعات DNA هدف سنتز شود.

از آن‌جایی که متد AOE-PCR متشکل از تنها یک چرخه overlap extension بوده و فاقد مرحله دناتوراسیون پس از مخلوط کردن محصولات asymmetric PCR که هر کدام به عنوان پرایمری برای دیگری عمل می‌کنند می‌باشد، توالی‌های الگوی وایلدتایپ به هیچ وجه تکثیر نخواهند شد. در حالت ایده‌آل تمام قطعات واردشده به وکتور باید DNA جهش‌یافته باشند که تضمین‌کننده کارایی بالای جهش‌زایی است و باعث کاهش هزینه انتخاب قطعه‌ جهش‌یافته با توالی‌یابی از بین کل قطعات موجود می‌شود.

همچنین AOE-PCR تعدادی مراحل وقت‌گیر و دشوار در OE-PCR مانند خالص‌سازی ژل پس از پایان نخستین مرحله PCR و مرحله آماده‌سازی پیش از دومین PCR را از میان برمی‌دارد. به علاوه، راند دوم PCR در AOE-PCR، به تنها یک چرخه از مراحل اتصال و گسترش تقلیل پیدا کرده است. این امر از تعداد چرخه‌های PCRای که باید انجام بگیرند می‌کاهد و درنتیجه احتمال تکثیر توالی‌های off-target نیز کمتر می‌شود. درنتیجه، متد AOE-PCR بسیار ساده‌تر و سریع‌تر از OE-PCR استاندارد است و می‌تواند در موارد بسیاری که از OE-PCR استفاده می‌شود، مانند موتاژنز site-directed و اتصال قطعات DNA به صورت in vitro به کار رود.

مزایا و معایب OE-PCR

OE-PCR از جمله تکنیک‌های مورداستفاده در موتاژنز site-directed بوده و درنتیجه به عنوان ابزاری مفید در آنالیز عملکردی ژن‌ها و توالی‌های تنظیم‌کننده آن‌ها مطرح می‌باشند. این تکنیک‌ها همچنین در موتاژنز multiple-site و اتصال in vitro توالی‌ها و ایجاد ژن‌های کایمریک کاربرد دارند.

 محدودیت پروتکل‌های موجود OE-PCR در آن است که از PCR عادی استفاده می‌کنند؛ درنتیجه تنها دو قطعه DNA با حداکثر طول ۳-۴ kb را می‌توانند به یکدیگر متصل کنند. اخیرا انواع تغییریافته‌ای از این تکنیک توصیف شده‌اند که می‌توانند بیش از ۱۰ قطعه DNA را به یکدیگر اتصال دهند؛ اما طول فرآورده نهایی محدود به ۵.۵ کیلوباز بوده است.