Touchdown PCR به منظور افزایش اختصاصیت PCR به کار می‌رود. از جمله راه‌های رسیدن به این هدف، تغییر دادن پارامترهای مربوط به هر چرخه است. در Touchdown PCR، این تغییر در مرحله اتصال چرخه ایجاد می‌شود. به این نحو که در اولین چرخه‌ها، دمای اتصال چند درجه بالاتر از حداکثر نقطه ذوب پرایمرها است و سپس رفته‌رفته کاهش می‌یابد تا زمانی که به دمای بهینه اتصال پرایمرها که برابر یا کمی پایین‌تر از حداقل نقطه ذوب پرایمرها است، “touchdown” کند. این تکنیک برای نخستین بار در سال ۱۹۹۱ ارائه شد و قابلیت اجرا روی دستگاه‌های PCR را دارا است.
PCR علیرغم کاربرد گسترده‌ای که در بیولوژی و علوم پزشکی دارد، غالبا مشکلات فراوانی را نیز برای آزمایشگران ایجاد می‌کند. بخش عمده این مشکلات مربوط به تولید محصولات غیراختصاصی و دایمرهای پرایمر و صرف زمان و منابع فراوان به منظور اصلاح و رفع ایرادات (troubleshooting) ذکرشده است. تولید محصولات چندگانه خصوصا در ژنوم‌های پیچیده رخ می‌دهد و علت آن اتصال نادرست پرایمرها است که اغلب در اثر تخمین اشتباه Tm و شرایط نامناسب مرحله اتصال واکنش رخ می‌دهد. این قطعات معمولا کوتاه‌تر از توالی هدف هستند و به صورت ترجیحی بیشتر از محصولات اختصاصی واکنش تکثیر می‌شوند و درنتیجه به سرعت از کارایی واکنش می‌کاهند. در صورتیکه توالی هدف به مقدار کمی در نمونه وجود داشته باشد، احتمال وقوع این موضوع افزایش می‌یابد.
مقاله مرتبط: PCR چیست؟
متدهای مختلفی به منظور افزایش اختصاصیت واکنش و جلوگیری از تکثیر غیراختصاصی پیشنهاد شده‌اند که در مجموع بهینه‌سازی نامیده می‌شوند. از جمله این روش‌ها می‌توان به افزودن موادی مانند DMSO، formamide و betaine، تغییر در غلظت نمک‌ها مانند یون منیزیم،dNTPها، پرایمرها و توالی الگو و تغییر در دمای مرحله اتصال اشاره کرد. مهم‌ترین این پارامترها تعیین دمای اتصال واکنش است.
عملکرد هرگونه واکنشی که اساس آن هیبریداسیون بین نوکلئیک‌اسیدهای دو رشته‌ای است، بستگی به دمای ذوب این رشته‌ها (Tm) دارد. Tm دمایی است که نیمی از مولکول‌های DNA تک‌رشته‌ای و نیمی دیگر دورشته‌ای هستند. دمای مرحله اتصال PCR، ۴ الی ۵ درجه سانتیگراد کمتر از Tm توالی‌های پرایمر-الگو در نظر گرفته می‌شود. همچنین اختلاف Tm دو پرایمر مورداستفاده نباید بیش از ۵ درجه باشد. پس میزان موفقیت و توانایی هر آزمایش PCR در تولید محصولات موردنظر معمولا بستگی به محاسبه دقیق متغیر Tm دارد. تخمین نادرست این کمیت می‌تواند منجر به کاهش کارایی PCR گردد؛ به این صورت که اگر دمای اتصال بسیار پایین باشد، دایمرهای پرایمر و محصولات غیراختصاصی تشکیل خواهند شد، و اگر این دما بسیار بالا باشد، به علت کاهش اتصال پرایمر به الگو، تولید محصول کاهش خواهد یافت.
فاکتورهایی مختلفی اعم از محتوای نوکلئوتیدی، ترتیب توالی نوکلئوتیدها، غلظت هر کدام از DNAهای دورشته‌ای و یون‌ها و شرایط بافر بر Tm تاثیر می‌گذارند. متدهای مختلفی برای محاسبه Tm با در نظر گرفتن این موارد وجود دارد، اما مقایسه اعداد به دست آمده در متدهای مختلف حاکی از تقریبی بودن آن‌ها و نیز وجود تفاوت‌هایی معنی‌دار میان آن‌ها است. پس رفتار پرایمرها در شرایط واقعی واکنش غیرقابل پیش‌بینی و متفاوت با مقادیر محاسبه شده بر اساس تئوری است. یکی از روش‌های تجربی تعیین دمای اتصال مناسب، انجام چندین آزمایش PCR یکسان با دماهای اتصال متفاوت و بررسی محصولات است که بسیار زمان‌بر و دشوار است.
پس با اینکه روش‌های گفته شده می‌توانند موثر واقع شوند، با این حال کارایی آن ها به میزان زیادی وابسته به آزمون و خطا است و تجربی هستند. به این معنی که ممکن است در مورد برخی از پرایمرها موثر واقع شوند و در مورد برخی دیگر بی‌اثر باشند. در نتیجه استفاده از آن‌ها باعث هدررفت زمان و منابع می‌گردد. راهکاری ساده‌تر برای رفع این مشکل Touchdown PCR است که به منظور جلوگیری از اتصال نادرست پرایمرها و تولید محصولات اختصاصی طراحی شده است و محدودیت‌های موجود در تعیین دقیق Tm را از بین می‌برد.
اساس Touchdown PCR، آغاز چرخه‌های اولیه واکنش در دماهایی بالاتر از دمای اتصال پیش‌بینی شده به صورت تقریبی و یا محاسبه‌شده (به روش دلخواه آزمایشگر) است. تعداد محدودی از چرخه‌ها به این ترتیب انجام می گیرند. این دما سپس طی ۱۰ تا ۱۵ چرخه کاهش می‌یابد تا زمانی که به دمای touchdown که همان Tm موردنظر است، برسیم. استفاده از دمای بالا در چرخه‌های آغازین، به نفع اتصال و تکثیر پرایمرهایی است که بیشترین میزان مکمل بودن را با توالی الگو دارند. پس این چرخه‌ها در تولید محصولات موردنظر بسیار تاثیرگذار هستند و جلوی تولید دایمرهای پرایمر و اتصالات غیراختصاصی پرایمرها را می‌گیرند. البته چنین دمای بالایی می‌تواند منجر به افزایش جدایی پرایمرها از توالی هدف و کاهش محصول گردد. کاهش دمای اتصال در چرخه‌های بعدی، با بهره‌گیری از امپلیکون‌های مناسب تولید شده در ابتدا، مانع از کاهش محصول می‌شود. به تدریج با پیشرفت روند واکنش، این امپلیکون‌ها بر محصولات غیراختصاصی و دایمرهای پرایمر در صورت وجود، غلبه می‌کنند.
پس Touchdown PCR با بهره‌گیری از ماهیت تکثیر نمایی PCR، باعث کاهش قابل توجه محصولات غیراختصاصی در پایان واکنش می‌گردد. به عنوان مثال در صورتیکه دمای اتصال واکنش را در هر چرخه ۰.۵°C کاهش دهیم، به ازای هر اتصال درست پرایمر نسبت به اتصال نادرست، میزان تولید محصول موردنظر در هر چرخه ۲ برابر و یا در هر در درجه چهار برابر تغییر می‌کند. در نتیجه در تغییر ۵ درجه‌ای دما، این افزایش ۴۵ برابر به نفع کاهش محصولات ناشی از اتصال نادرست پرایمر خواهد بود.
مراحل اولیه انجام Touchdown PCR، مانند آماده‌سازی توالی الگو، طراحی پرایمر، بهینه‌سازی و … مانند PCR عادی است. البته برخلاف مشکلات ذکر شده در محاسبه دقیق Tm، همچنان ناچار به تخمین مقدار آن هستیم تا بتوانیم برنامه چرخه حرارتی را به صورت موثری طراحی کنیم. صرف نظر از متد مورد استفاده برای این کار، باید در هر بار انجام واکنش روش یکسانی مورداستفاده قرار گیرد تا نتایج مستحکم‌تری حاصل شوند.
چرخه حرارتی دارای دو فاز جداگانه است. فاز اول، فاز Touchdown PCR نام دارد و با دمای اتصالی بالاتر از Tm پرایمرهای مورداستفاده شروع و در طی چرخه‌های متوالی کاهش پیدا می‌کند؛ تا زمانی که به دمای Touchdown برسیم. فاز دوم هم شامل فرایند تکثیر عادی در این دما است. فرایندی که در Nature Protocol منتشر شده است بسیار موثر است و به این صورت انجام می‌شود:
فاز اول با دمای اتصال Tm + ۱۰°C آغاز می‌شود و در طی ۱۰-۱۵ چرخه، دمای اتصال در هر چرخه ۱°C کاهش می یابد تا زمانی که به Tm محاسبه شده برسیم. در فاز دوم واکنش تکثیر در ۲۰-۲۵ چرخه با دمای اتصال نهایی در چرخه اول، انجام می‌گیرد. تعداد کلی چرخه‌ها نباید بیش از ۳۰-۳۵ باشد، وگرنه احتمال تولید قطعات غیراختصاصی و یا دایمرهای پرایمر افزایش خواهد یافت. لازم به ذکر است که در صورت عدم حصول به اختصاصیت و میزان محصول موردنظر، می‌توان محدوده دمایی کاهش، میزان کاهش دما در هر چرخه یا چرخه‌ها و نیز تعداد کلی چرخه‌ها را تغییر داد.
Touchdown PCR راهی ساده برای تقویت واکنش‌های PCR است؛ با این حال ممکن است پژوهشگران به مواردی برخورد کنند که هیچ گونه محصولی تولید نشود و یا اینکه محصولات چندگانه با اندازه‌های نادرست تولید گردند. در چنین شرایطی استفاده از hot start PCR همراه با Touchdown PCR می‌تواند بسیار مفید واقع شود. این تکنیک جلوی اتصال نادرست پرایمر را با حذف یکی از مواد اولیه اصلی واکنش پیش از مرحله دناتوراسیون و یا با افزودن یک مهارکننده قابل برگشت پلیمراز می‌گیرد. hot start همچنین اختصاصیت واکنش را با جلوگیری از تشکیل دایمرهای پرایمر در چرخه‌های آغازین، افزایش داده و تکثیر توالی‌های دشوار را آسان‌تر می‌کند.
مقاله مرتبط: معرفی تکنیک hot start PCR
این گونه است که Touchdown PCR به محدودیت‌های محاسبه Tm و دمای اتصال و نیز تغییرات اتفاقی در PCR که میزان محصول و اختصاصیت را کاهش می‌دهند غلبه کرده و تکنیکی ساده و قدرتمند را برای افزایش دقت واکنش فراهم می‌کند؛ بدون آنکه نیازی به تغییر غلظت مواد اولیه، افزودن enhancerها، طراحی مجدد پرایمرها و تعیین دقیق دمای اتصال باشد. این روش زمینه اختصاصی‌ترین اتصالات پرایمر و الگو را فراهم می‌کند و می‌تواند به عنوان بخش استانداردی از هر PCR به کار رفته و اختصاصیت و تولید محصولات را افزایش دهد.
Touchdown PCR همچنین این پتانسیل را دارد که به مشکلات مربوط به دمای بالای مرحله اتصال که در مورد برخی از ترکیب‌های پرایمر و الگو ضروری است، غلبه کند. Touchdown PCR علاوه بر اینکه کمک فراوانی به افزایش اختصاصیت واکنش‌هایی که نیاز فراوانی به آن دارند می‌کند، تاثیر منفی و مخربی بر واکنش‌هایی که ایده‌آل و بهینه هستند، نیز ندارد. به عبارت دیگر Touchdown PCR حتی در واکنش‌های با دمای اتصال بهینه‌شده نیز، علیرغم استفاده از دماهای اتصال پایین‌تر، به تولید امپلیکون‌های اختصاصی ادامه می‌دهد.
Touchdown PCR همچنین در مواقعی که میزان مکمل بودن پرایمر و هدف و درنتیجه Tm دقیقا مشخص نیست، به کار می‌رود؛ خصوصا زمانی که در RT-PCR از پرایمرهای degenerate استفاده می‌کنیم. استفاده از این تکنیک در مواقعی که می‌خواهیم توالی‌های چندگانه (multiplex) را که دارای پرایمرهایی با Tm متفاوت هستند تکثیر کنیم نیز کاربرد دارد؛ هرچند کارایی آن در روش‌های monoplex بیشتر است. Touchdown PCR در SNP typing بسیار موثر است.
Touchdown PCR خصوصا زمانی که تکثیر توالی الگو دشوار است، دارای کاربرد فراوانی است؛ مانند وجود ساختارهای ثانویه پیچیده در توالی الگو، وجود جزایر دارای درصد G-C بالا در ژنوم و وجود درصد G-C بالای ۶۰ درصد در ژنوم ارگانیسم حاوی توالی هدف. تنها محدودیت موجود در این تکنیک نامناسب بودن آن در بررسی کمی غلظت توالی هدف است. real-time PCR این عملکرد را دارد و دارای بهینه‌سازی‌های مخصوص به خود است.
مقاله مرتبط: تکنیک Real-time PCR
Stepdown PCR
Stepdown PCR مشابه Touchdown PCR است و تنها تفاوتی که با آن دارد، بزرگی میزان کاهش دمای اتصال در هر چرخه است. در Touchdown PCR این کاهش تدریجی و کوچکتر می‌باشد. Stepdown PCR به عنوان جایگزینی برای Touchdown PCR و به منظور غلبه بر مشکل طولانی بودن تنظیم دستی هر تغییر دما در دستگاه‌های thermocycler طراحی شد. از آن جایی که دستگاه‌های thermocycler مدرن دارای امکان تنظیم اتوماتیک افزایش و یا کاهش دمای اتصال در هر چرخه هستند، انجام Stepdown PCR اصلا ضرورتی ندارد.
