تکنیک Photonic PCR

تکنیک PCR از پرکاربردترین و مفیدترین تکنیک‌های تشخیصی مورداستفاده در ژنتیک است که انجام آن حدود یک ساعت زمان می‌برد. در سال ۲۰۱۵، محققان دانشگاه برکلی کالیفرنیا نوعی از این تکنیک را ارائه کردند که تنها ۵ دقیقه به طول می‌انجامد. این تکنیک photonic PCR نام دارد و از LED (light emitting diode) به منظور گرم کردن و سرد کردن سریع نمونه‌های DNA بهره می‌گیرد. انرژی و فضای موردنیار برای انجام این فرایند نیز بسیار کمتر از PCR عادی است. Photonic PCR می‌تواند روش تشخیصی در دسترس و قابل حملی را در فرمت چیپ فراهم آورد و در فیلدهای فراوانی مانند پزشکی دقیق و شخصی‌شده، تحقیقات کشاورزی، علوم جنایی و محیط‌ زیستی به کار برده شود. این تکنیک، سیستمی ایده‌آل به منظور انجام تست‌های فوق سریع ژنومی است که می‌تواند در هر جایی از جمله مناطق روستایی و بخش‌های اورژانس استفاده شود.

مقالات مرتبط:

• هر آن‌چه باید در مورد PCR بدانید!
• معرفی تکنیک PCR-SSCP
• معرفی تکنیک Methylation-specific PCR

تکنیک PCR عادی برای راه‌اندازی چرخه حرارتی ترموسایکلرهای bench-top استفاده می‌کنند. این ترموسایکلرها معمولا از واحد فلزی گرم‌کننده‌ای بهره می‌گیرند که توسط المان‌های Peltier تغذیه می‌شوند. از صفحات گرم‌شونده (hotplates) به منظور تنظیم دمای داخل لوله واکنش استفاده می‌کند. این روش، ساده و موثر بوده و به منظور کاهش زمان تکثیر ارتقای زیادی یافته است. با این حال، این فرایند حدود یک ساعت زمان می‌برد که در مقایسه با تکنیک Photonic PCR، زمان نسبتا زیادی محسوب می‌شود. این زمان نسبتا طولانی موردنیاز به منظور افزایش و کاهش دمای محلول DNA در ترکیب با هزینه بالا، انرژی موردنیاز برای به‌کارگیری دستگاه گرم‌کننده‌ای که باید به صورت ینواخت ۹۶ تا ۳۸۴ چاهک پلاستیکی PCR را حرارت دهد، و نیز نیاز به حجم واکنشی در حد چند ده میکرولیتر در هر چاهک، استفاده از PCR را در تشخیص‌های بالینی غیرعملی می‌کنند.

از آن‌جایی که توسعه تکنیک‌های PCR سریع و فوق سریع در کاربردهایی مانند تشخیص سریع بیماری‌های عفونی، بیماری‌های قلبی، سرطان، اختلالات نورولوژیکی و شناسایی سریع پاتوژن‌ها و جنگ‌افزارهای زیستی در مرحله point-of-care (POC) موردنیاز است، تاکنون موسسات بسیاری اقدام به بهبود سیستم‌های PCR کرده‌اند. به منظور ارتقای مراقبت‌های بهداشتی در سطح جهانی، روش‌های تشخیصی POC در محیط‌هایی کم‌امکانات مانند کشورهای درحال توسعه نیز باید قابل استفاده باشند. ازاین‌رو، چنین سیستم‌هایی باید قابل حمل، دقیق و ساده بوده و همزمان با کوچکی و انسجام ساختار، مصرف انرژی پایینی داشته باشند.

امروزه سیستم‌های سریع و فوق سریع PCR که بر پایه میکروفلوئید هستند نیز در حال توسعه‌ بوده و با کاهش اندازه نمونه و افزایش سرعت انتقال حرارت، زمان موردنیاز برای تکثیر را کاهش می‌دهند. یکی از رویکردهای موجود در این دسته، گرما دادن انتخابی به قطرات آب، به واسطه پرتوهای مادون قرمز تولیدشده توسط لیزر مادون قرمز است که از ویژگی جذب بالای آب در طول موج‌هایی بالاتر از ۱۰۰۰ نانومتر بهره می‌گیرد. ایرادی که وجود دارد، خطای انسانی در تولید قطرات از مخلوط PCR است که به ضرر تست‌های POC می‌باشد.

ایده استفاده از فوتونیک (منابع نوری) به منظور کنترل دما در PCR و با بهره‌گیری از حرارت‌دهی پلاسمونیک فوتوترمال نانوپارتیکل‌ها، قبلا در تکنیک‌ دیگری نیز مطرح شده است. به عنوان مثال، تیمی از محققان SRI international به طور موفقیت‌آمیزی از لیزر به منظور کنترل دمای نانو قطره‌ای از روغن که حاوی واکنش PCR بود استفاده کردند. آنان با استفاده از دستگاهی که خود طراحی کرده بودند، توانستند واکنش PCR ۴۰ چرخه‌ای را در عرض ۳۷۰ ثانیه تکمیل کنند. این سیستم‌ها به علت نیاز به دستگاه‌های لیزر و سیستم‌های تشخیصی گران‌قیمت و نیز نبود فرایندهایی قبل اتکا در تهیه نانوپارتیکل‌های از جنس طلا، به منظور انجام تست‌های POC مناسب نیستند.

تکنیک فوق سریع Photonic PCR از فیلم نازک طلا به عنوان مبدل نور به گرما و از LED به عنوان منبع گرما استفاده می‌کند. این تکنیک توانسته است به سرعت شگفت‌انگیزی دست پیدا کند: ۱۳ درجه سانتیگراد بر ثانیه در طی گرم کردن و ۶.۶ درجه سانتیگراد بر ثانیه در طی سرد کردن. این به معنی دستیابی به دستگاه ترموسایکلری با کارایی بالاست که می‌تواند در کمتر از ۵ دقیقه، ۳۰ بار بین دماهای ۵۵ تا ۹۵ درجه سانتیگراد نوسان کرده و ۳۰ چرخه را در عرض ۵ دقیقه تکمیل نماید. همان‌طور که گفتیم، تکمیل شدن تکنیک PCR عادی نزدیک به یک ساعت طول می‌کشد.

منبع نوری مورداستفاده در Photonic PCR، LEDهایی با توان پایین (۳.۵-W) هستند که می‌توان آن ها را به آسانی تهیه کرد. علت استفاده از LED نیز همین توان پایین آن است که در مقابل توان چندصد واتی موردنیاز برای ماشین PCR عادی است. جذب بالای نوری ورقه نازک طلا (۶۵٪، ضخامت ۱۲۰ نانومتر) در اثر تبدیل نور به گرما، تولید حرارت می‌کند که در عرض ۳ دقیقه می‌تواند دمای محلول اطرافش را تا حدود ۱۵۰ درجه سانتیگراد افزایش دهد.

اساس تبدیل نور به گرما در Photonic PCR، پدیده plasmonic photothermal است که مجموعه فعل‌وانفعالات میان نور و الکترون‌های آزاد موجود در سطح فلز و یا به عبارتی برهم‌کنش فوتون-الکترون-فونون می‌باشد. طی این فرایند، الکترون‌های موجود در سطح فلز توسط نیروی الکترومغناطیسی ذرات نور به سرعت برانگیخته می‌شوند. درنتیجه، زمانی‌ که فوتون‌های ساطع‌شده از منبع نوری روی سطح فلز (در این مورد ورقه نازک طلا) تابیده می‌شوند، به کمک پلاسمون، میزان بسیار بالایی از جذب نوری رخ می‌دهد. این امر الکترون‌های موجود در نزدیکی سطح فلز را برانگیخته می‌کند. نتیجه تولید الکترون‌هایی داغ است که با توجه به ظرفیت گرمایی پایینشان می‌توانند به دماهایی در حد چندین هزار درجه کلوین دست یابند. این الکترون‌ها همچنین قادر به منتشر شدن سریع در تمام سطح ورقه نازک طلا بوده و توزیع یکنواختی از الکترون‌های داغ را پدید می‌آورند.

به دنبال مرحله گرم شدن سریع الکترون‌ها، سرد شدن رخ می‌دهد و به این ترتیب تعادل در اثر مبادله انرژی میان الکترون‌های داغ و فنون‌ها پس از ۱۰-۵ پیکوثانیه حاصل می‌شود. درنتیجه، با تابش نور به ورقه طلا، اختلاف دمای بسیار زیادی میان سطح داغ فلز و محلول خنک اطراف آن به وجود می‌آید، که منجر به گرم شدن محلول پس از طی زمان ۱۰۰ پیکوثانیه می‌گردد. با خاموش شدن منبع نور، محلول در اثر انتشار سریع گرما از ورقه طلایی که دارای هدایت گرمایی بالایی است، مجددا سرد می‌گردد. ماشین PCRای را تصور کنید که می‌تواند دمای لوله واکنش را با سرعت نور و تنها با خاموش و روشن کردن منبع نوری، بالا و پایین ببرد!

پس از بارها آزمون و خطا، تیم محققان Photonic PCR بهترین ترکیب از طول موج LED و نوع سطح فلزی مورداستفاده در واکنش PCR را کشف کردند. LED با نور آبی که دارای قله طول موج ۴۵۰nm است، به همراه لایه‌ای نازک به قطر ۱۲۰nm از طلا که روی چیپی پلاستیکی حاوی چاهک‌های میکروفلوئیدی سوار شده‌اند، بهترین ترکیب است. اندازه چاهک‌ها در حدی است که بتواند محلول DNA و مواد اولیه PCR را در خود جای دهد. طلا بهترین انتخاب به عنوان واسط گرمایی است. از جمله علل این موضوع، توانایی بالای آن در جذب انرژی نورانی و واکنش‌پذیری پایین آن با مواد موجود در واکنش PCR و درنتیجه پیشگیری از آلودگی است.

در این تکنیک، می‌توان چندین واکنش PCR را توسط یک LED هدایت کرد. حالت دیگر، استفاده از چاهک‌های مالتیپل متصل به ردیف‌هایی از LEDهای متفاوت است که هر کدام بر اساس دمای اتصال پرایمرهای طراحی‌شده مورداستفاده تنظیم شده‌اند. این نوع از چرخه حرارتی، از آن جایی که می‌تواند چندین تست متفاوت را در یک مرتبه انجام آزمایش به پایان برساند، به منظور انجام تست‌های تشخیصی POC فوق سریع ایده‌آل است.

پس طی فرایند Photonic PCR، نور از LEDهای واقع در زیر فیلم نازک طلایی به روی فیلم تابانده شده و این کار گرمایی را تولید می‌کند که می‌تواند به منظور تولید گرما و افزایش دمای محلول DNA به کار رود. با خاموش کردن منبع نور، الکترون‌های طلا تولید گرما را متوقف کرده و محلول DNA به سرعت سرد می‌شود. به این نحو، ۳۰ چرخه PCR در کمتر از ۵ دقیقه و با کیفیت تکثیری PCR عادی تکثیر می‌گردند.

استفاده از پلاسمونیک، گامی بزرگ در مسیر تکنولوژی PCR است. متد ارائه شده توانسته است زمان موردنیاز برای انجام ۴۰ چرخه PCR را از یک ساعت به ۵ دقیقه کاهش دهد. پتانسیل‌های فراوانی در Photonic PCR نهفته است. این سیستم PCR به علت انجام فوق سریع چرخه‌های حرارتی، قابلیت مالتیپلکس شدن، توان مصرفی پایین، کاهش استرس‌های محیطی، مقاوم به شرایط نگهداری نامساعد دستگاه، هزینه کم راه اندازی و سادگی سازمان آن، می‌تواند تکنیکی ایده‌آل برای انجام تست‌های POC باشد. در این راستا، محققان در تلاشند دستگاه‌هایی در اندازه گوشی تلفن همراه بسازند که با باتری کار می‌کنند و می‌توانند در هر موقعیتی استفاده شوند. سرعت بالای این تکنیک کمک بزرگی به تکنیک‌های توالی‌یابی فعلی و آینده مانند Illumina و توالی‌یابی nanopore خواهد کرد. این امر با پدید آوردن امکان تولید حجم عظیمی از داده‌ها، منجر به گام‌هایی بزرگ در تولید علم خواهد شد. بنیاد بیل و ملیندا گیتس، حمایتی ۱.۵ میلیون دلاری از توسعه این تکنیک کرده‌اند.