PCR چیست؟ PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction) در زیست‌شناسی مولکولی به‌منظور ساخت میلیون‌ها کپی از قطعه DNA موردنظر، به‌کارمی‌رود. این تکنیک برای نخستین بار در سال ۱۹۸۳ توسط Kary Mullis، شیمی‌دان آمریکایی، ابداع شد. وی به مناسبت این دستاورد مهم در سال ۱۹۹۳ برنده جایزه نوبل گردید. PCR امکان تولید میلیون‌ها نسخه از یک قطعه مشخص موجود در مقادیر اندک DNA را فراهم می‌کند. در این مقاله سعی کرده‌ایم که شما را به ساده‌ترین شکل ممکن به پاسخ سوال «PCR چیست» برسانیم.
مدت زمان کوتاهی پس از اختراع PCR توسط مولیس، این تکنیک انقلابی را در بیولوژي مولکولی پدید آورد و باعث افزایشی ناگهانی در سرعت پیشرفت مطالعات ژنومی شد. امروزه با استفاده از PCR قادر به استخراج هر ژنی از هر ارگانیسمی هستیم. سرعت، حساسیت بسیار بالا و robustness تکنیک PCR، آن را به تکنیکی معمول در تحقیقات آزمایشگاهی پزشکی و زیست‌شناسی که به این سه مشخصه نیاز دارند، تبدیل کرده است.
عدم نیاز به باکتری‌ها برای تکثیر، PCR را به روشی سریع و آسان تبدیل کرده‌است؛ خصوصا اگر توالی کامل ژنوم ارگانیسم مشخص باشد. این روش تکنیکی معمول در تحقیقات آزمایشگاهی پزشکی و زیست‌شناسی است و از آن در پردازش DNA برای توالی‌یابی، تعیین وجود یا عدم وجود یک ژن خاص به منظور تشخیص عامل عفونت و تهیه پروفایل DNA در تحقیقات جنایی استفاده می‌شود. حساسیت PCR بسیار بالاست؛ به‌طوری‌که می‌تواند مقدار کم DNA موجود در قطره خون به‌جامانده در صحنه جرم، و یا نسخه‌های اندکی از ژنوم ویروسی موجود در خون بیمار را تشخیص دهد.
اساس واکنش PCR چیست و چگونه انجام می‌گیرد؟
تکنیک PCR چیست؟ PCR با بهره‌گیری از اصول اولیه فرایند طبیعی سنتز DNA و همانندسازی، مولکول‌های DNA را در داخل لوله آزمایش کپی می‌کند. در داخل سلول‌های زنده، سیستمی پیچیده که متشکل از تعداد فراوانی پروتئین است، همانندسازی ژنوم را انجام می‌دهد: دو رشته DNA از هم باز می‌شوند و هر رشته مولکول مادر به عنوان الگویی برای تولید رشته‌های مکمل دختر مورد استفاده قرار می‌گیرد. اساس این نسخه برداری، همان قانون معروف واتسون و کریک است: A همواره با T و G همواره با C جفت می‌شود.
- PCR مشابه یک دستگاه فتوکپی است و همانند این دستگاه که نیاز به موادی مثل کاغذ، جوهر و سخت‌افزار دارد، PCR نیز نیازمند مواد اولیه خاصی است. پنج جزء اصلی برای انجام PCR مورد نیاز است که در ادامه به نقش دقیق هر کدام از آن‌ها بیشتر خواهیم پرداخت:
- نمونه DNAای که قرار است از آن کپی تهیه شود.
- رشته‌های کوتاهی از DNA به نام پرایمرها، که آغازگر واکنش PCR هستند. پرایمرها به‌گونه‌ای طراحی می‌شوند که بتوانند از سمت ۳ پریم هر دو رشته به توالی موردنظر متصل شوند؛ از این رو به دو نوع پرایمر نیاز خواهیم داشت.
- نوکلئوتیدها (dNTPها) که واحدهای ساختمانی DNA بوده و برای ساخت رشته جدید مورد نیاز می‌باشند.
- آتزیم Taq پلیمراز که بازهای جدید را به ساختار DNA می‌افزاید.
- بافر که شرایط مناسب انجام آزمایش PCR را فراهم می‌کند.
- در PCR گرم کردن و سرد کردن به‌صورت پشت سر هم و توسط دستگاه انجام می‌گیرد. این فرایند چرخه حرارتی نام دارد.
- آزمایش PCR سه مرحله اصلی دارد:
- دناتوراسیون (Denaturation): DNA دورشته‌ای حرارت داده می‌شود تا به دو DNA تک‌رشته‌ای تبدیل شود.
- اتصال (Annealing): دما به میزانی پایین آورده می‌شود تا پرایمرها بتوانند به رشته الگو متصل شوند.
- گسترش (Extending): با افزایش دما، رشته جدید توسط آنزیم Taq پلیمراز شروع به ساخته‌شدن می‌کند.
- این سه مرحله، ۲۰ الی ۴۰ بار تکرار می‌شوند و در هر مرتبه تعداد کپی‌های تهیه شده از هر DNA دو برابر می‌شود.
- یک آزمایش PCR می‌تواند در کمتر از یک ساعت به طور کامل به انجام برسد. البته مدت زمان انجام آن به سرعت دستگاه‌ها نیز بستگی دارد.
- پس از انجام شدن PCR، از تکنیک الکتروفورز برای بررسی تعداد قطعات تولید شده و اندازه آن‌ها استفاده می‌شود.
مراحل اصلی PCR
در هر مرحله از PCR چه فرایندهای رخ می‌دهند؟
مرحله دناتوراسیون
- طی این مرحله تمام پنج جزء اصلی نام‌برده‌شده از جمله DNA الگو تا دمای ۹۵-۹۴ درجه سانتیگراد حرارت داده‌می‌شوند.
- دمای بالا باعث از هم گسستن پیوندهای هیدروژنی بین بازها شده و دو رشته DNA جداگانه حاصل می‌گردد.
- این دو رشته به‌عنوان الگویی برای ساخت رشته‌های جدید DNA عمل می‌کنند.
- مدت زمان افزایش دما تا این حد باید به میزانی باشد که تمام مولکول‌های DNA دو رشته‌ای شوند.
- این فرایند معمولا ۳۰-۱۵ ثانیه طول می‌کشد.
مرحله اتصال
- در این مرحله، دما تا حدود ۶۵-۵۰ درجه سانیگراد پایین می‌آید. درنتیجه پرایمرها با پیوند هیدروژنی به نقاط اتصال مخصوص به خود در DNA تک رشته‌ای متصل می‌شوند. البته دمای دقیق به نقطه ذوب پرایمر مورد استفاده بستگی دارد.
- پرایمرها توالی‌های تک‌رشته‌ای DNA یا RNA هستند که طولی به اندازه ۳۰-۲۰ باز دارند و انتهای ۳ پریم مورد نیاز برای آغاز فعالیت پلیمراز و سنتز DNA را تهیه می‌کنند.
- پرایمرها توسط آزمایش‌گر به گونه‌ای طراحی و ساخته می‌شوند که توالی‌شان مکمل دو انتهای ۳ پریم توالی DNA موردنظر باشد. پرایمرها این توانایی را دارند که نقطه شروع قطعه را در هر دو رشته از ژنوم مکان‌یابی کنند.
- پرایمرها به عنوان تعیین کننده نقطه شروع سنتز DNA جدید عمل می‌کنند؛ چون آنزیم DNA پلیمراز تنها می‌تواند بازهای جدید را به DNA دو رشته‌ای بیفزاید. پس از اتصال پرایمر است که پلیمراز نیز متصل شده و ساخت رشته مکمل را آغاز می‌کند.
- دو رشته جدا شده DNA مکمل هم بوده ولی در دو جهت متفاوت قرار دارند (منظور از جهت نحوه قرارگیری انتهاهای ۳ پریم و ۵ پریم است). در نتیجه ۲ نوع پرایمر خواهیم داشت: Forward Primer و Reverse primer. به بیان دیگر، دو پرایمر به دو انتهای ۵ پریم موجود متصل می‌شود.
- این مرحله ۳۰-۱۰ ثانیه زمان می‌برد.
مرحله گسترش
مقاله مرتبط: مکانیسم‌های مولکولی اصلی در همانندسازی DNA
- طی این مرحله، دما تا ۷۲ درجه سانتیگراد افزایش داده می‌شود. درنتیجه آنزیم Taq DNA پلیمراز فعال شده و افزودن بازهای آلی و سنتز رشته جدید را از سمت ۵ پریم به ۳ پریم شروع می‌کند.
- Taq DNA پلیمراز آنزیمی است که از نوعی باکتری گرمادوست به نام Thermus aquaticus گرفته‌شده‌است.
- محیط زندگی این باکتری غالبا چشمه‌های آب گرم است و در نتیجه می‌تواند حرارت بالای ۸۰ درجه سانتیگراد را تحمل کند.
- DNA پلیمراز باکتری، در دماهای بالا پایدار است. این به آن معنی است که می‌تواند دمای بالایی را که برای جدا کردن دو رشته DNA از همدیگر در مرحله دناتوراسیون مورد نیاز است، تحمل کند. در نتیجه افزودن آنزیم پس از هر بار انجام شدن چرخه، مورد نیاز نخواهد بود.
- DNA پلیمراز بسیاری از ارگانیسم‌ها قادر به تحمل این دما نیست. به عنوان مثال، دمای مناسب برای فعالیت پلیمراز انسانی ۳۷ درجه سانتیگراد است.
- دمای بهینه آنزیم Taq DNA پلیمراز ۷۲ درجه است. این آنزیم به پرایمر متصل شده و نوکلئوتیدها را به DNA تک رشته‌ای می‌افزاید.
- مدت زمان این مرحله بستگی به طول توالی موردنظر دارد. کپی شدن هزار باز DNA حدود یک دقیقه زمان می‌برد.
مقاله مرتبط: انگشت نگاری DNA چیست؟
-
- چرخه حرارتی که شامل این سه مرحله است، ۲۰ تا ۴۰ مرتبه تکرار می‌شود و هر چرخه نیز حدود ۵ دقیقه به طول می‌انجامد تا کپی‌های فراوانی از قطعه DNA دلخواه‌مان تهیه شود.
-
- قطعات DNA جدیدی که حین PCR تولید می‌شوند نیز به عنوان الگو عمل کرده و Taq DNA پلیمراز به این قطعات متصل شده و رشته جدید را تولید می‌کند.
-
- نتیجه تولید میلیون‌ها کپی از بخش خاصی از DNA در مدت زمانی بسیار کوتاه است.
-
- PCR بهترین روش موجود برای کلون کردن قطعات نسبتا کوتاه DNA (کمتر از ۱۰۰۰۰ جفت نوکلئوتید) است. قطعات RNA نیز می‌توانند با این روش کپی شوند اما ابتدا باید تحت تاثیر آنزیم رونوشت بردار معکوس (Reverse Transcriptase) به صورت DNA دربیایند.
- حساسیت PCR بسیار بالاست و می‌تواند عوامل بیماری‌زا را حتی در مراحل اولیه عفونت تشخیص دهد. در این گونه موارد، توالی‌های کوتاهی که مکمل ژنوم عامل بیماری‌زا هستند، ساخته و به عنوان پرایمر مورد استفاده قرار می‌گیرند. پس از انجام چرخه‌های متعدد، حتی نسخه‌های اندک ژنوم باکتریایی یا ویروسی قابل تشخیص هستند.
نقش پرایمرها در PCR چیست
PCR نیازمند سنتز یک سری توالی‌های الیگونوکلئوتیدی است که در سنتز DNA جدید به صورت انتخابی، به عنوان پرایمر عمل می‌کنند. پرایمرها در موفقیت PCR و یا شکست آن نقشی کلیدی دارند. در صورت طراحی صحیح پرایمرها، آزمایش منجر به تکثیر یک قطعه DNA واحد می‌گردد که منطبق بر ناحیه هدف در مولکول الگو است. در صورت طراحی نادرست، واکنش با شکست روبه‌رو خواهد شد.
تعیین توالی مناسب برای پرایمر کار دشواری نیست: پرایمرها، اختصاصی دو توالی بلافاصله مجاور ناحیه هدف بوده و طولی در حدود ۱۸ تا ۲۵ نوکلئوتید دارند. برای اینکه هیبریداسیون بتواند اتفاق بیفتد، هر پرایمر باید از لحاظ توالی مکمل رشته هدف باشد. همچنین انتهای ۳’ دو پرایمر مورد استفاده باید به سمت یکدیگر قرار بگیرند.
سنتز پرایمرها از روی توالی‌های هدف معینی صورت می‌گیرد، پس به این منظور باید اطلاعاتی در مورد این توالی‌ها داشته باشیم. در حالت ایده‌آل، قطعات DNA موردنظر نیز نباید طولی بیش از ۳ کیلوباز و کمتر از یک کیلوباز داشته باشند. البته قطعاتی با طول بیش از ۱۰ کیلوباز نیز می‌توانند با تکنیکهای PCR استاندارد تکثیر شوند، اما این نکته را نیز باید مدنظر داشت که با افزایش طول قطعات، بازده فرایند تکثیر کاهش خواهد یافت.
طول پرایمرها از جمله مهم‌ترین پارامترها در سنتز پرایمر است. در صورتیکه پرایمرها کوتاه‌تر از حد باشند، ممکن است به نقاط غیراختصاصی متصل شده و محصولات غیراختصاصی تولید کنند. به عنوان مثال، در صورتیکه در یک آزمایش PCR، برای DNA توتال انسانی از پرایمری ۸ نوکلئوتیدی استفاده شود، به احتمال زیاد، قطعات مختلفی تکثیر خواهند شد.
حال سوال این است که چرا پرایمرهای طولانی‌تری ساخته نمی شوند؟ طول پرایمر سرعت هیبریداسیون آن با DNA هدف را تحت تاثیر قرار می‌دهد و پرایمرهای کوتاه‌تر با سرعت کمتری هیبرید می‌گردند. درنتیجه کارایی PCR که بر اساس تعداد قطعات تکثیرشده در حین آزمایش تعیین می‌گردد، کاهش خواهد یافت. علت این موضوع ، افزایش طول پرایمرها و عدم هیبریداسیون کامل آن‌ها با توالی الگو در مدت زمان تعیین شده در چرخه می‌باشد. پرایمرهای با طول بیش از ۳۰ نوکلئوتید ندرتا مورد استفاده قرار می‌گیرند.
در بسیاری از واکنش‌ها هدف تکثیر یک توالی DNA واحد است؛ در این موارد، از اهداف مهم، کاهش احتمال اتصال پرایمر به نقاطی غیر از نقطه موردنظر است. پس نباید از توالی‌های تکراری استفاده نمود. به منظور حصول اطمینان از مکمل نبودن بازهای داخل یک پرایمر با یکدیگر، توالی پرایمر نباید محتوی تکرارهای معکوس (inverted repeats) و یا هر گونه توالی self-complementary با طولی بیش از ۳ جفت‌باز باشد. به منظور جلوگیری از اتصال دو پرایمر به یکدیگر و تشکیل دایمر پرایمر، توالی ۳’ هیچ یک از پرایمرها نباید در هیچ کدام از جایگاه‌ها مکمل خود و یا پرایمر دوم باشد.
دایمرهای پرایمر، محصول گسترش پرایمر از روی خود و یا پرایمری دیگر هستند. از آن‌جایی که این محصولات حاوی توالی یکی از پرایمرها و یا هر دوی آن‌ها و نیز توالی مکمل این پرایمرها هستند، الگوی مناسبی برای واکنش‌های تکثیر بعدی فراهم می‌کنند. نسخه‌برداری آسان‌تر مولکول‌های کوچکتر باعث بدتر شدن شرایط نیز می‌شود. دایمرهای پرایمر می‌توانند در واکنش PCR غالب شده و پرایمر ار از توالی هدف حقیقی خود جدا نمایند.
انواع تکنیکهای PCR چیست
- هر آنچه که باید در مورد PCR بدانید!
- معرفی تکنیک RT-PCR
- معرفی تکنیک Real-time PCR
- معرفی تکنیک Multiplex PCR
- معرفی تکنیک Long PCR
- معرفی تکنیک Nested PCR
- معرفی تکنیک QF-PCR
- معرفی تکنیک Digital PCR
- معرفی تکنیک Hot start PCR
- معرفی تکنیک PCR اختصاصی متیلاسیون
- معرفی تکنیک فوتونیک PCR
- معرفی تکنیک نانوپارتیکل PCR
- معرفی تکنیک Competitive PCR
- معرفی تکنیک PCR-SSCP
- معرفی تکنیک Touchdown PCR
- معرفی تکنیک FLAG
- معرفی تکنیک RFLP
- معرفی تکنیک AFLP
- معرفی PCR VNTR
- معرفی تکنیک MLPA
- معرفی تکنیک Inverse PCR
- معرفی qPCR arrayها
- معرفی تکنیک ARMS
- معرفی تکنیک overlap extension PCR
- معرفی تکنیک Assembly PCR
- معرفی تکنیک LATE
- معرفی تکنیک Colony PCR
- معرفی تکنیک COLD
مختصر و بسیار مفید… ممنونم
خیلی به درد بخور بود مرسی