تکنیک های استخراج DNA

پایه تمام تحقیقات بیوتکنولوژي، دستکاری DNA و آنالیز آن است. پیش از تمامی تکنیک‌ها،  به عنوان مثال به منظور تهیه DNA نوترکیب و تست‌های تشخیصی، محققان نیازمند متدهایی به منظور استخراج DNA از ارگانیسم‌های مختلف و خالص‌سازی آن تا حد معینی هستند. تکنیک‌هایی که برای استخراج DNA استفاده می‌شوند، بسته به منبع نمونه، اندازه و قدمت آن متفاوتند. علیرغم تنوع فراوان این روش‌ها، اشتراکاتی هم مابین آن‌ها وجود دارد و آن جدا کردن DNA از سایر اجزای سلولی است. این DNA می‌تواند DNA کروموزومی، پلاسمید و یا باکتریوفاژ باشد و می‌تواند از تمام نمونه‌های بیولوژیکی مانند بافت‌های زنده و فیکس‌شده، سلول‌ها، اجزای ویروسی و سایر نمونه‌ها، استخراج شود. استخراج DNA باید به ملایم‌ترین شیوه ممکن لیز بافت صورت بگیرد تا از آسیب به DNA و شکستن آن به قطعات کوچکتر جلوگیری شود.

استخراج DNA برای نخستین بار در سال ۱۸۶۹توسط فردریش میشر، پزشک سوئیسی، انجام گرفت. وی تلاش کرد که به منظور آزمایشات خود، سلول‌ها را از گره‌های لنفاوی استخراج کند، اما تامین غلظت مناسبی از لنفوسیت‌ها بسیار دشوار و حتی غیرممکن بود. درنتیجه، سلول موردنظر او به لوکوسیت‌ها تغییر یافت که از چرک تجمع یافته در پانسمان‌های جراحی به دست می آمدند. در ابتدا، تمرکز میشر روی انواع مختلف پروتئین‌هایی بود که لوکوسیت‌ها را تشکیل می‌دهند و توانست نشان دهد که پروتئین‌ها ماده اصلی تشکیل‌دهنده سیتوپلاسم سلول‌ می‌باشند. در حین این آزمایشات، وی متوجه شد که در صورت افزودن اسید به محلول، ماده‌ای ته‌نشین شده و با افزودن باز دوباره حل می‌گردد. به این ترتیب برای نخستین بار، رسوب ناخالصی از DNA به دست آمد.

میشر به منظور جدا کردن DNA از پروتئین موجود در عصاره‌های سلولی، پروتکلی جدید به منظور جدا کردن هسته از سیتوپلاسم طراحی کرد و سپس DNA را استخراج نمود. نخستین پروتکل نتوانست به توید میزان محصول کافی منجر شود، و نیاز به پروتکلی دومی بود که نوکلئین خالص‌شده بیشتری را تهیه کند. نوکلئین، بعدها توسط ریچارد آلت‌من نوکلئیک‌اسید نام گرفت. پس از میشر تلاش‌های دیگری نیز به این منظور صورت گرفت و باعث پیشرفت‌های فراوان دیگری در فرایند استخراج DNA شد.

نخستین پروسه‌های آزمایشگاهی روتین برای استخراج DNA، بر پایه استراتژی‌های سانتریفیوژ بر اساس چگالی توسعه یافتند. Meselson و Stahl در سال ۱۹۵۸ از این متد برای توضیح همانندسازی نیمه‌حفاظت‌شده DNA استفاده کردند. پروسه‌های بعدی از تفاوت‌های موجود در حلالیت DNAهای بزرگ کروموزومی، پلاسمیدها و پروتئین‌ها در بافر قلیایی بهره بردند. هم اکنون متدهای اختصاصی فراوانی برای استخراج DNA خالص ایجاد شده‌اند و اکثرا به صورت کیت‌های تجاری موجودند.

استخراج DNA برای آنالیز ژنتیکی آن به منظور اهداف علمی، پزشکی و جنایی، ضروری است. دانشمندان از DNA استخراج شده در مواردی همچون وارد کردن DNA بیگانه به درون سلول‌ها و یا در تشخیص استفاده می‌کنند. در پزشکی این کار ارزش تشخیصی دارد. در امور جنایی از DNA استخراج شده در تعیین هویت افراد استفاده می‌شود. منابع DNA مورد استفاده بسیار متنوع بوده و می‌تواند از هر ارگانیسم زنده و غیرزنده‌ای به دست آید. منابع معمول عبارتند از خون کامل، مو، اسپرم، استخوان‌ها، ناخن‌ها، بزاق، سلول‌های اپی‌تلیال، ادرار، باکتری‌ها و… .

واضح است که هر کدام از روش‌های استخراج DNA باید مطابق با نمونه موردنظر باشند، به نحوی که بتوان با استفاده از آن‌ها به طور موثری DNA را از نمونه موردنظر جداسازی نمود. مسئله بعدی اندازه نمونه است. به عنوان مثال روش استخراج از یک نمونه کوچک مانند اسپرم یا یک تار مو با روش مورد استفاده در مورد چند میلی‌لیتر خون متفاوت است. فاکتور مهم دیگر، طول عمر نمونه است. نمونه ممکن است تازه و یا ذخیره‌شده باشد. نمونه‌های ذخیره‌شده ممکن است از خون و یا بافت منجمد شده، استخوان و یا نمونه‌های باستانی انسان‌ها، حیوانات و گیاهان به دست آیند.

استخراج DNA از باکتری‌ها آسان‌ترین فرایند استخراج است؛ چون سلول‌های باکتریایی دارای ترکیبات ساختاری فراوانی زیر دیواره سلولی و غشای خود نیستند. باکتری‌هایی مانند E. coli، از آن جایی که فرایند استخراج DNA آسان‌تری دارند، ارگانیسم انتخابی به منظور دستکاری تمام انواع ژن‌ها می‌باشند. در E. coli ، هر دو نوع DNA ژنومی و پلاسمید موجود است و نحوه افتراق آن‌ها از همدیگر، طول بسیار بلندتر DNA ژنومی است.

استخراج DNA معمولا با لیز یا از هم گسستن بافت و سلول‌ها آغاز می‌شود و به این منظور غشای سلولی باید تخریب گردد. این فرایند برای تخریب ساختارهای پروتئینی و نیز آزاد کردن اسیدنوکلئیک از هسته ضروری است. در حالت کلی، لیز نمونه در محلول نمکی حاوی دترجنت‌ها و پروتئازها مانند Proteinase K انجام گرفته و این کار موجب از هم گسستن ساختارهای سلولی و حل شدن غشا می‌شود. در باکتری‌ها، آنزیمی به نام لیزوزوم، پپتیدوگلیکان‌ها را که ترکیب اصلی دیواره سلولی هستند، هضم می‌کند. سپس شوینده‌ای (detergent) مانند سدیم دودسیل سولفات (SDS) با بر هم زدن ساختار لیپیدی دو لایه، غشا را تخریب می‌نماید.

در مورد سایر ارگانیسم‌ها نحوه تخریب سلول، بستگی به ساختارشان دارد.

نمونه‌های بافتی از جانوران و گیاهان، باید به قطعات کوچکتری تقسیم شوند، تا ترکیبات داخل سلولی‌شان آزاد گردد. سلول‌های گیاهی باید ابتدا در مخلوط‌کن کاملا تکه‌تکه شوند تا دیواره‌های سلولی سخت شکسته شوند. سپس بافت دیواره به کمک آنزیم‌ها هضم می‌گردد تا پلیمرهای بلند لیگنین و سلولز به صورت مونومر دربیایند. DNA موجود در بافت‌های جانوری مانند نوک دم موش، پس از تجزیه بافت توسط پروتئیناز K و حل شدن غشا توسط شوینده‌ها صورت می‌گیرد. سلول‌های کشت‌شده آسان‌ترین سلول‌ها به منظور استخراج DNA هستند، چون دارای دیواره سلولی و ساختارهای دیگری در خارج از غشای سلولی خود نمی‌باشند. کاری که شوینده انجام می‌دهد، تنها تخریب غشا به منظور آزادسازی ترکیبات داخل سلولی است. هر ارگانیسم و بافتی نیازمند ایجاد یک سری تغییرات جزئی در فرایند به منظور آزادسازی ترکیبات داخل سلولی مانند DNA می‌باشد.

لیز سلول‌ها و بافت‌های نرم آسان است؛ اما گاهی نیاز داریم که این کار را در مورد بافت‌های سختی مانند استخوان، چوب نیز انجام دهیم. بسیاری از نمونه‌های گیاهی چوبی در نیتروژن مایع منجمد شده و بلافاصله به صورت پودرخرد می‌شوند. استخوان‌ها حاوی مواد معدنی فراوانی هستند و باید پیش از استخراج یون‌ها از آن برداشته شوند تا بعدا در فرایندهایی مانند PCR اختلال ایجاد نکنند. پس از آنکه این پردازش‌ها روی نمونه انجام گرفت، باید هموژنیزاسیون توسط دستگاه‌های لازم انجام گیرد تا مخلوط یکنواخت شده و سپس عمل لیز کردن انجام شود.

پس از آزاد شدن ترکیبات داخل سلولی، باید آن‌ها را از بقایای غشای سلولی، استخوان‌، غضروف، دیواره سلولی و … و توسط سانتریفیوژ و یا به طریق استخراج شیمیایی جدا نمود. سانترفیوژ کردن باعث جدایی ذرات بر اساس اندازه‌شان می‌شود، چون مولکول‌های بزرگتر و سنگین‌تر زودتر از مولکول‌های کوچکتر ته نشین می‌شوند. به علاوه موادی که در فاز آبی نامحلول هستند، لخته‌هایی را تشکیل می‌دهند که سریع‌تر در کف لوله سانتریفیوژ ته‌نشین می‌گردند. به عنوان مثال، پس از تخریب دیواره سلولی، قطعات حاصل از آن کوچکتر از مولکول‌های DNA می‌گردند. سانتریفیوژ باعث می‌شود که مولکول‌های DNA به صورت یک توده در آمده و قطعات محلول دیواره سلولی در لوله باقی بمانند.

متد دیگری که به منظور جدا کردن قطعات سلولی استفاده می‌شود، استخراج شیمیایی با استفاده از فنول به منظور جداسازی پروتئین‌های ناخواسته از DNA است. فنول اسیدی است که می‌تواند ۶۰ تا ۷۰ درصد مولکول‌های زیستی از جمله پروتئین‌ها را از بین ببرد. فنول چندان در آب محلول نیست و پس از مخلوط شدن با نمونه آبی حاوی DNA و پروتئین، دو فاز مخلوط از یکدیگر جدا می‌شوند. پروتئین در لایه فنولی و نوکلئیک‌اسید در لایه آبی قرار می‌گیرد. دو لایه توسط سانتریفیوژ از یکدیگر جدا می‌شوند و به این ترتیب DNA موجود در لایه آبی از فنول جدا می‌گردد.

پس از جدا شدن مولکول‌های DNA از پروتئین‌ها، نمونه هنوز دارای هر دو نوع نوکلئیک‌اسید RNA و DNA است. از آن‌جایی که RNA نیز یک نوکلئیک اسید است، در فنول محلول نیست. آنزیمی به نام ریبونوکلئاز (RNase)، RNA را به ریبونوکلئوتیدها تبدیل می‌کند. در نتیجه این کار، تولید نمونه‌‌ DNA ای است که در محلولی از قطعات RNA و ریبونوکلئوتیدها قرار دارد. در صورت افزودن حجم یکسانی از الکل، قطعه بسیار بزرگ DNA از فاز آبی جدا و توسط سانترفیوژ استخراج می‌گردد و ریبونوکلئوتیدها به صورت محلول باقی می‌مانند. DNA حاصل می‌تواند در آزمایشات مختلف استفاده شود.

در مهندسی ژنتیک معمولا سه نوع DNA استخراج می‌شود: کل DNAهای موجود در سلول  (Total DNA)، DNA پلاسمید و DNA  باکتریوفاژ. Total DNA اغلب به عنوان منبع تهیه ژن‌ها به منظور کلون کردن استفاده می‌شود و شامل DNA ژنومی ارگانیسم و سایر مولکول‌های DNA موجود در آن مانند پلاسمید است.

روش استخراج DNA خالص پلاسمیدی، همانند total DNA است، با این تفاوت که در یکی از مراحل پلاسمید باید از سایر مولکول‌های DNA جدا شود. DNA  پلاسمیدها در فرایندهای بیولوژي مولکولی مدرن

باکتریوفاژ غالبا زمانی استخراج می‌شود که به عنوان وکتور مورد نیاز باشد و معمولا از ذرات ویروسی استخراج می‌شود، نه از سلول‌های باکتریایی آلوده به ویروس. البته استثنائاتی هم وجود دارد. در این حالت تکنیک‌های خاصی باید برای از میان ‌بردن کپسید به کار رود. برای اینکه درک اصول استخراج DNA آسان شود، ساده‌ترین نوع آن یعنی استخراج Total DNA از یک کشت باکتری را شرح خواهیم داد.

مقاله مرتبط: مهندسی ژنتیک چیست؟

PCR چیست؟

استخراج DNA از کشت باکتری

این فرایند قابل تقسیم به ۴ مرحله اصلی است:

1. باکتری‌ها کشت داده می‌شوند:

بیشتر باکتری‌ها می‌توانند در یک محیط کشت مایع مانند محیط برات (broth) به آسانی رشد کنند. محیط کشت باید بتواند غلظت مناسبی از مواد مورد نیاز باکتری را فراهم کند تا بتوانند به صورت موثر رشد کرده و تقسیم شوند. برداشت کلونی‌ها با سانتریفیوژ کردن کشت باکتری انجام می‌شود.

2. سلول‌ها لیز می‌شوند تا محتویاتشان آزاد شود (تهیه عصاره سلولی):

سلول باکتری با غشای سیتوپلاسمی و دیواره سلولی ضخیمی احاطه شده است. باکتری‌های گرم منفی، دارای ساختاری به نام غشای خارجی (outer membrane) نیز هستند. برای آزاد شدن محتویات داخل سلول، این موانع باید از بین بروند. تکنیک‌های مورد استفاده برای این منظور فیزیکی و یا شیمیایی می‌باشند. در روش‌های فیزیکی سلول‌ها با فشار مکانیکی پاره می‌شوند. در روش‌های شیمیایی لیز سلول‌ها توسط موادی انجام می‌گیرد که یک‌پارچگی ساختار این موانع را تحت تاثیر قرار می‌دهند.

مواد مورد استفاده در لیز شیمیایی بستگی به گونه باکتری مورد استفاده داشته و برای غشا و دیواره سلولی نیز متفاوتند. به عنوان مثال در E. coli و باکتری‌های مرتبط، تضعیف دیواره سلولی توسط لیزوزوم، EDTA (ethylenediamine tetraacetate) و یا ترکیبی از هر دو انجام می‌گیرد. لیزوزم ساختارهایی که موجب استحکام دیواره سلولی می‌شوند را می‌شکند. EDTA نیز یون‌های منیزیم را چلاته می‌کند. این یون‌ها برای حفاظت از ساختار کلی دیواره سلولی مورد نیاز بوده و همچنین برای فعالیت آنزیم‌های تجزیه کننده DNA ضروری می‌باشند. استفاده از این دو ماده برای از هم پاشیدن سلول باکتری کافی است. با این حال معمولا دترجنت‌هایی مانند sodium dodecyl sulfate (SDS) نیز افزوده می‌شوند. این مواد با برداشتن مولکول‌های لیپید به فرایند لیز سلول‌ها کمک می‌کنند.

با لیز شدن سلول‌ها، مرحله نهایی در تهیه عصاره سلولی، زودن زوائد سلولی نامحلول مانند قطعات تجزیه نشده دیواره سلولی است که می‌تواند توسط سانتریفیوژ جداسازی شود.

3. عصاره سلولی تحت تاثیر موادی قرار می‌گیرد که همه اجزا به جز DNA از بین بروند:

عصاره سلولی علاوه بر DNA حاوی مقادیر زیادی از RNA و پروتئین است. یکی از روش‌های خالص‌سازی DNAها از این مخلوط، استفاده از آنزیم‌های آلی تجزیه کننده این ناخالصی‌هاست. روش استاندارد زدودن پروتئین‌ها استفاده از فنول و یا مخلوط ۱:۱ فنول و کلروفورم است. این حلال‌های آلی باعث ته‌نشین شدن پروتئین‌ها می‌شوند، درحالیکه اسیدنوکلئیک‌ها به صورت محلول می‌مانند. اگر مخلوط سانتریفیوژ شود، توده لخته‌شده و سفید پروتئین بین دو لایه آلی در پایین و آبی در بالا قرار می‌گیرد.

در برخی عصاره‌ها مقدار پروتئین به حدی زیاد است که یک بار انجام شدن این فرایند کافی نیست و باید چندین بار تکرار شود. اما باید این مورد را هم در نظر داشت که با هر بار انجام این مراحل، تعدادی از مولکول‌های DNA می‌شکنند. راه‌حل استفاده از پروتئازهایی مانند pronase و یا proteinase K پیش از استفاده از فنول است. در نتیجه پلی‌پپتدها به واحدهای کوچکتر شکسته شده و راحت‌تر توسط فنول برداشته می‌شوند.

برخی از مولکول‌های RNA خصوصا mRNAها توسط فنول برداشته می‌شوند؛‌ اما بسیاری از آن‌ها در لایه آبی همراه مولکول‌های DNA باقی می‌مانند. تنها روش حذف آن‌ها استفاده از RNaseهاست.

۴. تغلیظ DNA

استخراج DNA با مواد آلی محلول غلیظی تولید می‌کند و نیاز به تغلیظ ندارد. سایر روش‌های خالص‌سازی DNA که محلول‌های رقیقی ایجاد می‌کنند نیاز به خالص‌سازی دارند.معمول‌ترین روش تغلیظ، ethanol precipitation نام دارد.

فرایند استخراج DNA بسیار ساده است و می‌توانید حتی در خانه آن را انجام دهید. برای انجام این کار می‌توانید سبزیجات و یا گوشت را با افزودن آب و نمک هموژنیزه کنید. با افزودن مواد شوینده پروتئین‌ها و لیپیدها از DNA جدا می‌شوند. آنزیم‌های موجود در موادی مانند آب آناناس باعث ته‌نشین شدن پروتئین‌ها شده و DNA به درون محلول آزاد می‌شود. با افزودن الکل به مخلوط حاصل شده، DNA به سطح می‌آید و می‌توان آن را مشاهده کرد.

اساس کیت‌های تجاری که به این منظور استفاده می‌شود، مشابه روش گفته‌شده است با این تفاوت که از مواد اولیه متفاوتی استفاده می‌شود. در این کیت‌ها، ترکیبات محلولی که برای لیز به کار می‌رود عبارت است از: کلرید سدیم، tromethamine که بافری برای ثابت نگه‌داشتن pH است، EDTA و SDS. پروتئیناز K آنزیمی است که معمولا در استخراج DNA استفاده می‌شود. پس از آزاد شدن نوکلوئیک‌اسیدها برای حذف RNA می‌توان از RNase, DNase free استفاده کرد.  

روش‌های قدیمی استخراج DNA که هنوز هم در FBI به کار می‌روند، از حلال‌های آلی استفاده می‌کنند. در این روش‌ها، محلول لیز شده با فنول،‌ کلروفورم و ایزوآمیل‌الکل مخلوط می‌شود. مخلوط فنول و کلروفورم باعث لیز شدن پروتئین‌ها می‌شود اما به نوکلوئیک‌اسیدها آسیبی وارد نمی‌کند. در نتیجه DNA و پروتئین از هم جدا می‌گردند. با سانتریفیوژ کردن امولسیون حاصل‌شده، حلال‌های آلی در در فاز زیرین و مولکول‌های DNA در فاز بالایی قرار می‌گیرند. در سطح تماس دو فاز نیز پروتئین‌های تجزیه شده جای می‌گیرند.محلول آبی حاوی DNA به طور مکرر تحت تاثیر آنزیم‌های تجزیه کننده پروتئین قرار می‌گیرد تا در نهایت محصولات پروتئین در فاصله بین دو فاز دیده نشوند.

این متد بسیار کارآمد است اما متاسفانه فقط در شرایطی کاربرد دارد که مقدار نمونه اولیه زیاد باشد. علاوه بر آن، حلال‌های آلی مورد استفاده در این روش برای سلامتی مضر هستند و استفاده از آن‌ها مشکلات ایمنی به همراه دارد. همچنین کیفیت DNA حاصل برای انجام فرایندهایی مانند توالی‌یابی DNA و PCR کافی نیست.

این تکنیک را می‌توان با افزودن غلظت بالایی از سدیم کلرید تا حدودی تصحیح کرد. به این صورت که پس از دناتوره‌شدن پروتئین‌های سلولی با استفاده از دترجنت‌ها و پروتئازها و با گذشت چند ساعت از انجام این کار، نمک به محلول اضافه می‌شود. در نتیجه نمک نوکلئیک‌اسید تشکیل شده و در حضور الکل می‌تواند با سانتریفیوژ جدا شود.