تکنیک Multiplex PCR

اغلب در مطالعات نیاز داریم که چندین توالی نوکلئیک‌اسیدی را با هم هدف قرار دهیم؛ به عنوان مثال در بررسی چندین اگزون از یک ژن و تشخیص جهش‌های آن. این کار به کمک Multiplex PCR انجام می‌گیرد و نوعی از PCR است که طی آن دو یا چند توالی هدف با افزودن بیش از یک پرایمر و در یک مخلوط آزمایش، تکثیر می‌شوند. در نتیجه قطعات DNA در اندازه‌های مختلفی تولید می‌شوند که اختصاصی توالی‌های مخصوص به خود هستند. با هدف قرار دادن چندین توالی در یک آزمایش، می‌توان تمام فرایندهای انجام گرفته در چندین تست را در یک تست خلاصه کرد. تعداد این اهداف از ۲ تا ۵۰ عدد متغیر است و طول هر توالی باید کمتر از ۵ کیلوباز باشد. این تکنیک می‌تواند در زمان و هزینه صرفه‌جویی کند، بی آن‌ که از کارایی آزمایش کاسته شود.

Multiplex PCR روشی سریع و آسان در تشخیص کلینیکی و کارهای تحقیقاتی است. این تکنیک نخستین بار در سال ۱۹۸۸ و به عنوان روشی برای تشخیص جهش‌های حذفی در ژن dystrophin مورد استفاده قرار گرفت. در سال ۲۰۰۸ نیز از آن برای آنالیز میکروستلایت‌ها و SNPها استفاده شد. Multiplex PCR می‌تواند به تنهایی برای آنالیز اطلاعات ژنتیکی به کار رود و یا اینکه مقدمه فرایندهایی همچون توالی‌یابی و هیبریداسیون DNA باشد. این متد در بسیاری از آزمایشات DNA مانند بررسی ژن‌های حذف شده، آنالیز جهش‌ها و پلی‌مورفیسم‌ها و RT-PCR به کار می‌رود. همچنین در زمینه بیماری‌های عفونی، ابزاری باارزش برای تشخیص ویروس ها، باکتری‌ها و انگل‌هاست.

مقاله مرتبط: انگشت نگاری DNA چیست؟

بهینه سازیMultiplex PCR

حضور بیش از یک جفت پرایمر در تکنیک Multiplex PCR باعث می‌شود که احتمال تشکیل پیوند هیدروژنی بین پرایمرها (و در نتیجه تشکیل هترودایمرهای پرایمر) و یا بین پرایمرها و محصولات PCR افزایش یابد. این امر احتمال خطا و تشکیل محصولات زاید را افزایش داده و درنتیجه بازده تکثیر برخی از قطعات و یا همه آن‌ها را کاهش می‌دهد. این اتفاقات می‌توانند باعث هدررفت قابل توجه سرمایه و زمان شوند. در نتیجه سنتز پرایمرها در Multiplex PCR باید بهینه سازی شود.

مقاله مرتبط: PCR چیست؟

به انجام رساندن Multiplex PCR به نحوی موثر معمولا نیازمند برنامه‌ریزی‌های متعدد برای بهینه‌سازی شرایط واکنش است. یکی از مهم‌ترین مسائل در PCR نسبت مناسب تعداد توالی‌های پرایمر به توالی‌های الگو است و تنظیم مناسب آن می‌تواند از تشکیل دایمرهای پرایمر جلوگیری کند. عامل تعیین‌کننده این نسبت اندازه توالی‌های الگو و میزان پیچیدگی آن‌ها است. اگر این نسبت خیلی بالا باشد، مثلا در صورت رقیق بودن محلول حاوی توالی الگو و یا افزودن بیش از حد پرایمر، دایمرهای پرایمر تشکیل خواهند شد. در صورت کم بودن بیش از حد این نسبت، میزان افزایش محصول به صورت لگاریتمی رخ نخواهد داد. علت این پیامد، به هم پیوستن دوباره توالی‌های الگو پس از دناتوره شدن و از بین رفتن پیوندهای هیدروژنی مابین آن‌ها و عدم اتصالشان به پرایمرهاست؛ درنتیجه دایمرهای پرایمر با مصرف مواد اولیه واکنش، بیش از توالی موردنظر تکثیر خواهند شد.

بهینه‌سازی Multiplex PCR باید بتواند چنین فعل و انفعالات غیراختصاصی را کاهش دهد. در طراحی پرایمرها باید فاکتورهایی مانند هومولوگ بودن پرایمرها با توالی الگو، طول، نسبت G-C و غلظت آن‌ها باید مورد توجه قرار گیرد. اتصال پرایمرها به همدیگر و تشکیل دایمر در دماهای پایین پیش از شروع چرخه حرارتی (۴-۲۵° C) می‌تواند رخ دهد و Hot start PCR از این اتفاق جلوگیری می‌کند.

در شرایط ایده‌آل، همه جفت پرایمرهای مورد استفاده در Multiplex PCR، باید بتوانند تکثیر توالی‌های مورد نظر را با بازدهی یکسانی انجام دهند. این هدف با استفاده از پرایمرهایی که دمای ذوب یکسانی دارند، محقق می‌شود (پرایمرهای با طول ۲۸-۱۸ جفت‌باز و حاوی ۶۰-۴۵٪ G-C). همچنین این پرایمرها نباید همانندی قابل توجهی از لحاظ ساختاری در داخل خود و یا با سایر پرایمرها داشته‌باشند.

تکثیر بیشتر برخی از توالی‌های هدف نسبت به سایرین، پدیده‌ای است که معمولا در Multiplex PCR رخ می‌دهد. دو فرایند مهمی که زمینه‌ساز این خطا هستند، عبارتند از: PCR drift (انحراف PCR) و PCR selection (انتخاب PCR). PCR drift خطایی است که در رابطه با افت‌وخیز واکنش‌های مابین reagents PCR رخ می‌دهد. PCR selection مکانیسمی است که احتمال تکثیر یک الگوی خاص را به علت ویژگی‌های آن، توالی‌های flanking و یا کل ژنوم هدف، افزایش می‌دهد.

افزایش غلظت سایر اجزای PCR مانند ترکیبات بافر، dNTPها، MgCl_۲ و آنزیم ها در Multiplex PCR نسبت به uniplex PCR، باعث افزایش قابل توجه در حساسیت و اختصاصیت این تست‌ها می‌شود. افزایش غلظت این فاکتورها احتمال جفت شدن نادرست پرایمر را با تولید محصولات غیراختصاصی و اشتباه، افزایش می‌دهند. با این حال، بهینه‌سازی این اجزا در Multiplex PCR معمولا مفید واقع می‌شود. تفاوت زیاد غلظت اجزای Multiplex PCR با Uniplex PCR نشان دهنده ماهیت رقابتی فرایند PCR است.

مزایای Multiplex PCR:

1. کنترل داخلی (Internal control): از مشکلات احتمالی PCR، نتیجه منفی کاذب و یا مثبت کاذب است. منفی کاذب در نتیجه عدم انجام واکنش و مثبت کاذب در نتیجه آلودگی رخ می‌دهد. منفی‌های کاذب غالبا در بررسی‌های پس از Multiplex PCR معلوم می‌شوند؛ چون هر amplicon یک کنترل داخلی را برای سایر قطعات تکثیرشده فراهم می‌کند.
2. بازده بالا: هزینه آماده سازی Multiplex PCR نسبت به انجام تست به صورت Uniplex و در لوله‌های آزمایش متعدد، بسیار کمتر است. این روش برای حفظ مواد اولیه گران قیمت و توالی‌های الگو بسیار مناسب می‌باشد.
3. نشان دهنده کیفیت توالی‌ الگو است: کیفیت توالی الگو در Multiplex PCR بهتر از واکنش PCR ساده معین می‌شود.
4. نشان دهنده کمیت توالی‌ الگو در نمونه است: تکثیر لگاریتمی و استانداردهای درونی Multiplex PCR می‌تواند برای ارزیابی میزان توالی الگو در نمونه مورد استفاده قرار گیرد. برای انجام دقیق این کار باید میزان اولیه الگو در نمونه، تعداد چرخه‌های انجام شده و حداقل مهار صورت گرفته روی دو برابر شدن محصولات در هر چرخه را باید در نظر بگیریم.