PCR نیازمند سنتز یک سری توالی‌های الیگونوکلئوتیدی است که در سنتز DNA جدید به صورت انتخابی، به عنوان پرایمر عمل می‌کنند. پرایمرها اختصاصی دو توالی بلافاصله مجاور رشته هدف بوده و طولی در حدود ۱۸ تا ۲۵ نوکلئوتید دارند. سنتز پرایمرها از روی توالی‌های هدف معینی صورت می‌گیرد، پس به این منظور باید اطلاعاتی در مورد این توالی‌ها داشته باشیم. به منظور اتصال موثرتر، پرایمرها باید به میزان زیادی مکمل توالی‌های احاطه‌کننده DNA هدف باشند.
پرایمرها در موفقیت PCR و یا شکست آن نقشی کلیدی دارند. در صورت طراحی صحیح پرایمرها، آزمایش منجر به تکثیر یک قطعه DNA واحد می‌گردد که منطبق بر ناحیه هدف در مولکول الگو است. در صورت طراحی نادرست، واکنش با شکست روبه‌رو خواهد شد. علت این موضوع، احتمالا رخ ندادن تکثیر و یا تکثیر بیش از یک قطعه است. در صورت عدم اتصال پرایمرها به نقاط مناسب، طولانی بودن فاصله بین دو پرایمر و تشکیل شدن hairpin در ساختار پرایمر به جای اتصال به توالی هدف، آنزیم Taq پلیمراز قادر به تکثیر قطعه هدف نخواهد بود. همچنین اگر هر دو پرایمر به رشته یکسانی متصل گردند، واکنش ادامه نخواهد یافت.
در بسیاری از واکنش‌ها هدف تکثیر یک توالی DNA واحد است؛ در این موارد، از اهداف مهم، کاهش احتمال اتصال پرایمر به نقاطی غیر از نقطه موردنظر است. پس نباید از توالی‌های تکراری استفاده نمود. به منظور جلوگیری از اتصال دو پرایمر به یکدیگر، توالی ۳’ هیچ یک از پرایمرها نباید در هیچ کدام از جایگاه‌ها مکمل پرایمر دوم باشد. به منظور حصول اطمینان از مکمل نبودن بازهای داخل یک پرایمر با یکدیگر، توالی پرایمر نباید محتوی تکرارهای معکوس (inverted repeats) و یا هر گونه توالی self-complementary با طولی بیش از ۳ جفت‌باز باشد.
برای اینکه اتصال پرایمر به توالی مکمل موردنظر با درجه اختصاصیت بالا صورت بگیرد، دمای مرحله اتصال باید در بیشترین مقدار ممکن باشد، به نحوی که از تشکیل جفت‌باز بین پرایمر و محل اتصا آن جلوگیری نشود. معیاری سودمند برای بررسی پایداری هر دوپلکس نوکلئیک‌اسیدی، دمای ذوب یا Tm آن است. Tm دمایی است که منطبق بر نقطه میانی تغییر مولکول‌های دورشته‌ای DNA به تک‌رشته‌ای قرار دارد. بیشترین اختصاصیت اتصال پرایمر معمولا در دمایی حدود ۵ درجه سانتیگراد پایین‌تر از Tm محاسبه شده رخ می‌دهد. در صورتی دمای مرحله اتصال خیلی پایین تر از دمای ذوب باشد ممکن است پرایمرها به نقاطی از DNA متصل شوند که تنها در بخشی از توالی با آن مکمل هستند.
