تکنیک PCR-VNTR

تکنیک PCR-VNTR به معنای PCR تکرارهای پشت‌ سر هم با تعداد متغیر (Variable Number Tandem Repeats) به منظور آنالیز آن‌ها است و مارکرهای بسیار مهمی را به منظور تشخیص هویت و نقشه‌برداری ژنومی فراهم می‌کند. آنالیز و مقایسه طول این VNTR ها اساس تکنیک انگشت‌نگاری DNA را تشکیل می‌دهد که در سال ۱۹۸۴ توسط پروفسور Alec Jeffrey اختراع شد. واریانت‌های لوکوس‌های VNTR، نخستین بار توسط آنالیز RFLP شناسایی شدند. این تکنیک بخش مهمی از آنالیز‌های DNA با اهداف جنایی را تشکیل می‌دهد.

مقالات مرتبط:

Alec Jeffreys توالی‌های core کوتاهی را شناسایی کرد که طولی در حدود ۱۰ تا ۱۵ جفت‌باز داشتند. این توالی‌ها در سراسر ژنوم پراکنده و هومولوگ لوکوس‌هایی بسیار پلی‌مورفیک بودند. وی با استفاده از پروب‌های مکمل تکرارهای پی‌درپی توالی core، توانست الگویی از این قطعات DNA بسیار متغیر را به دست آورد. این توالی‌های چندگانه با طول‌های متغیر که توسط واحدهای تکرارشونده تعیین می‌شوند، VNTR یا مینی‌ستلایت نام دارند و تهیه پروفایل آن‌ها، انگشت‌نگاری DNA نام گرفته است.

نخستین پرونده جنایی که در آن از شواهد حاصل از آنالیز VNTR استفاده شد، اثبات قتل دو دختر ۱۵ ساله توسط Colin Pitchfork در Narborough انگلستان بود. Lynda Mann در سال ۱۹۸۳ به قتل رسیده بود و مطالعات انجام گرفته روی نمونه منی گرفته شده از بدن مقتول، نشان داده بود که قاتل دارای گروه خونی A است. دو سال بعد، قتل Dawn Ashworth نیز توسط قاتلی با گروه خونی و پروفایل آنزیمی یکسان روی داد.

مظنون اصلی، از اهالی آن منطقه بود و سرانجام به قتل Dawn Ashworth اعتراف کرد اما کشتن Lynda Mann را انکار نمود. پلیس به انجام هر دو جنایت توسط یک فرد، مطمئن بود؛ در نتیجه تصمیم به استفاده از انگشت‌نگاری DNA که در آن زمان تکنیکی جدید بود، گرفت. DNA منی از نمونه‌های گرفته شده از هر دو جنایت استخراج و با DNA موجود در خون مظنون اصلی مقایسه گردید. این آنالیز اثبات کرد که هر دو جنایت توسط یک فرد صورت گرفته و نیز مظنون، عامل جنایت نبوده است. در نتیجه برای نخستین بار، فردی بی‌گناه با استفاده از پروفایل DNA از اتهام مبرا گردید.

در نتیجه از حدود ۵۰۰۰ مرد ساکن روستا و نواحی اطراف آن نمونه خون و بزاق تهیه شد. آنالیز انگشت نگاری DNA روی مردانی صورت گرفت که گروه خونی و پروفایل آنزیمی مشابهی با قاتل داشتند. در نهایت پروفایل Colin Pitchfork با پروفایل DNA گرفته شده از نمونه منی موجود در بدن قربانیان جنایت، تطبیق یافت و وی به عنوان متهم شناخته شد.

VNTR ها

توالی برخی از نواحی DNA مانند نواحی کدکننده مولکول‌های ساختاری، بسیار محافظت‌شده و ثابت می‌باشد؛ به گونه‌ای که بین ارگانیسم‌های متفاوت نیز تفاوت چندانی را نشان نمی‌دهد. در مقابل، نواحی دیگری نیز در داخل ژنوم وجود دارد که بسیار متغیر و حاوی توالی‌های تکراری DNA هستند. این نواحی به نام VNTRیا مینی ستلایت (minisatellite) خوانده می‌شوند و معمولا دارای عملکرد خاصی نیستند.

این موتیف‌ها در حالت طبیعی در ژنوم وجود داشته و حاوی ۲۰ الی ۱۰۰ (Biotech: 9 to 80- یه جای دیگه: ۵ تا ۵۰) جفت نوکلئوتید تکراری و پی‌درپی هستند. طول هر VNTR مشخص، در افراد مختلف متفاوت بوده و تعداد تکرارهای رخ داده نیز بسیار متغیر می‌باشد؛ به جز در دوقلوهای همسان. درنتیجه احتمال اینکه الگوی VNTR دو فرد غیرخویشاوند دقیقا مشابه یکدیگر باشد، بسیار پایین است. از این رو، الگوی این اجزای تکراری می‌تواند به عنوان مارکری در نقشه ژنومی (در مراحل اولیه پروژه ژنوم انسان) و به منظور شناسایی DNA افراد در پزشکی جنایی، تست ابوت و آنالیزهای تبارشناسی میان خانواده‌ها به کار گرفته شود.

احتمال وقوع یک واریانت VNTR معین، بستگی به ناحیه فوق متغیر (hypervariable) موردنظر دارد. به عنوان مثال، در صورتی که یکی از سیستم‌های آنالیز، ۳۶ نوع توالی DNA تکراری با اندازه‌های مختلف را از روی ناحیه هدف تولید کند، احتمال اینکه دو فرد غیرخویشاوند الگوی یکسانی را در هر ۳۶ جزء داشته باشند، حدودا برابر یک در ۵۰۰۰ میلیارد میلیارد است. این مقدار بیشتر از تعداد ذرات شن موجود در تمام سواحل زمین می‌باشد. این اصل است که پایه آنالیزهای VNTR و انگشت‌نگاری DNA را تشکیل می‌دهد.

VNTR ها علی‌رغم اینکه ژن نیستند، به عنوان سیستمی چند اللی تلقی شده و واریانت‌ها به عنوان الل‌های آن در نظر گرفته می‌شوند. مزیت استفاده از VNTR ها نسبت به SNP ها، همین چنداللی بودن VNTR ها است؛ در حالیکه SNP ها دو اللی می‌باشند. الگوی وراثت VNTR ها مندلی و از نوع هم‌-غالبی است. از این رو، تعدادی از نوارهای شناسایی شده در افراد ممکن است با پدر و یا مادرشان مشترک باشد.

برخی از این توالی‌های تکراری در چندین نقطه مختلف ژنوم یافت می‌شوند و در نتیجه نمی‌توانند در تهیه نقشه ژنومی به کار روند. در مقابل، برخی دیگر از توالی‌ها نیز تنها در یک نقطه خاص وجود دارند و این ویژگی آن‌ها را در موارد تهیه نقشه ژنتیکی قابل استفاده می‌کند. تعدادی از VNTR ها ۱۰۰ تا ۲۰۰ نوع واریانت دارند و این خصوصیت آن‌ها را به منظور استفاده در تحقیقات جنایی بسیار مناسب می‌کند. VNTR و سایر مارکرها مانند SNPها، RFLPها و میکروستلایت‌ها می‌توانند در تکنیک‌های فیزیکی نقشه‌برداری مانند نقشه‌برداری با استفاده از آنزیم محدودکننده و FISH نیز مفید واقع شوند. اما مسئله این جاست که ژنوم‌هایی به بزرگی ژنوم انسان نمی‌توانند تعداد کافی از مارکرها را فراهم کنند.

همان طور که اشاره شد، ناحیه‌هایی از مولکول که دارای VNTRها هستند، می‌توانند در تکنیک‌های انگشت نگاری DNA، مورد بررسی قرار ‌گیرند. در نتیجه این کار الگویی از نوارها ظاهر می‌شود که مگر در دوقلوهای همسان، در افراد مختلف متفاوت بوده و مانند اثر انگشت منحصر به فرد است. VNTRها معمولا در نواحی غیرکدکننده DNA واقع شده‌اند. از این رو، استفاده از VNTR ها، به علت عدم برملا شدن قسمت‌های کدکننده DNA افراد حین مطالعات جنایی، با حریم خصوصی افراد تعارضی ندارد.

تکنیک‌های ابتدایی انگشت‌نگاری، در عین قدرت بالا، پروسه‌ای طولانی داشته و نیازمند تعداد فراوان نیروی انسانی بودند. در این پروسه‌ها، نمونه DNA تحت تاثیر آنزیم محدودکننده‌ای که اختصاصی جایگاه‌های احاطه کننده VNTR است، قرار می‌گیرند. به علت تفاوت تعداد تکرارها در افراد مختلف، طبیعتا طول قطعات حاصل نیز متفاوت خواهد بود. در مرحله بعدی، قطعات حاصل در ژل آگارز الکتروفورز و طی فرایند ساترن بلاتینگ، به غشای نیتروسلولزی متقل می‌شوند. پس از ثابت شدن قطعات روی غشا، پروب‌های رادیولیبل شده DNA با واحدهای تکرارشونده که در کل طول لوکوس VNTR ثابت هستند، تشکیل هیبرید می‌دهند. در نتیجۀ قرار گرفتن غشا در برابر فیلم x-ray، سیگنال‌های رادیواکتیو ظاهرسازی می‌شود و الگوی VNTRها به دست می‌آید.

امروزه، قطعات DNA موردنیاز برای آنالیز VNTR توسط PCR-VNTR ایجاد می‌گردند؛ به این نحو که پرایمرهای مورداستفاده، اختصاصی نواحی احاطه‌کننده لوکوس‌های VNTR طراحی می‌شوند. با گسترش PCR، آنالیزهای VNTR نیز اختصاصیت و حساسیت بالایی پیدا کرده‌اند؛ زیرا در این صورت، مقادیر بسیار اندک خون، منی و مو نیز به منظور انجام انگشت نگاری DNA کافی می‌باشند. البته همانند گذشته، الگوی نوارها توسط الکتروفورز ایجاد و با ساترن بلاتینگ مشاهده می‌شود. یکی از مشکلات موجود در صورت الکتروفورز با ژل آگارز استاندارد، نزدیک به هم بودن نوارهای حاصل از لوکوس‌های چندگانه مورد بررسی و فشردگی آن‌ها است؛ به نحوی که تمایز قطعات مختلف ممکن نیست. انواع مختلف ژل مانند پلی‌آکریل‌آمید و الکتروفورز capillary، می‌توانند مشکل ایجاد نوارهای نزدیک به یکدیگر را حل کنند.

VNTR-PCR — تصویر ۱ . انگشت نگاری VNTR؛ DNA ژنومی دارای نواحی با توالی‌های تکراری است. در هر فرد تعداد تکرارها متغیر است و در نتیجه مقایسه طول هر کدام می‌تواند به منظور تشخیص هویت‌ استفاده شود. ناحیه با توالی‌ تکراری توسط PCR از اشخاص A، B و C جداسازی می‌شود. یکی از پرایمرهای PCR با رنگ فلورسنت لیبل شده می‌باشد. قطعات روی ژل آگارز الکتروفورز می‌شوند تا امکان مقایسه طولشان فراهم شود.

VNTR ها به دو دسته تقسیم می‌شوند: STR ها (short tandem repeats) که طولی در حدود ۱۰۰ الی ۳۰۰ جفت‌باز دارند و AMP-FLP ها (amplified fragment length polymorphisms) که طولشان حدودا ۳۵۰ تا ۱۰۰۰ جفت‌باز است.

لوکوس‌های STR در کل ژنوم انسان پراکنده بوده و بسیار پلی‌مورفیک می‌باشند. در توالی STR ها، طول هر تکرار ۲ تا ۶ (PCR: 3 to 7 یا حتی ۲ تا ۴) نوکلئوتید و تعداد تکرار واحدها در هر لوکوس ۴ تا ۴۰ بار می‌باشد. درنتیجه STRها به اندازه VNTR های با طول واحدهای تکرار بزرگتر، در تعداد تکرارها پلی‌مورفیک نیستند. در مطالعات جنایی، به طور معمول STR های با تکرارهای ۴ تا ۵ جفت‌بازی مورداستفاده قرار می‌گیرند. مزیت استفاده از STR ها در کارهای جنایی آن است که حتی مولکول‌های DNA به نسبت تجزیه شده و فرسوده نیز می‌توانند به علت کوچک بودن لوکوس‌های STR، به عنوان الگوی موفقی برای PCR عمل کنند.

بسیاری از STRها، تنها ۱۰ تا ۲۰ الل دارند و درنتیجه نمی‌توانند به تنهایی در تعیین هویت به کار روند. با این حال، تعداد لوکوس‌های STR در ژنوم فراوان است و در صورتی که چندین عدد از آن‌ها به صورت همزمان آنالیز شوند، داده‌های حاصل برای منحصر به فرد شدن الگوی به دست آمده از هر فرد، کافی خواهد بود. هر چه تعداد لوکوس‌های بررسی شده بیشتر باشند، نتایج قابل اعتمادتر خواهند بود. هنگام آنالیز تنوع موجود در ۵ تا ۱۰ لوکوس STR مختلف، احتمال یکسان بودن اثرانگشت ژنتیکی دو فرد تصادفی، یک در ده میلیارد خواهد بود و در صورت آنالیز ۳۶ لوکوس، این احتمال به یک در ۵۰۰۰ میلیارد میلیارد خواهد رسید.

Multiplex PCR امکان تکثیر یک یا چند لوکوس STR را به صورت همزمان فراهم می‌کند و عبارت است از راه‌اندازی چندین واکنش PCR در یک لوله آزمایش و با استفاده از چندین پرایمر متفاوت. با این حال اگر حساسیت و دقت بالای آنالیز مدنظر باشد، بهتر است تنها یک STR پلی‌مورفیک تکثیر گردد. مزیت آنالیزهای مالتیپلکس در سادگی و هزینه نسبتا پایین آن است. موفقیت این آنالیزها نیز وابسته به تکثیر موفق لوکوس‌های STR در کنار یکدیگر است که به سازگاری پارامترهای تکثیری مانند دمای اتصال مشابه پرایمرها بستگی دارد. پرایمرهای مورد استفاده نباید با یکدیگر تداخل کنند که دستیابی به این امر در انجام ۶ واکنش تکثیری یا بیشتر در کنار یکدیگر بسیار دشوار است.

آنالیز پلی‌مورفیسم لوکوس‌های STR، تقریبا همیشه بر پایه الکتروفورز در ژل پلی‌آکریل آمید (PAGE) است. علت این موضوع، نزدیک به هم بودن نوارهای حاصل از لوکوس‌های چندگانه در آنالیزهای مالتیپلکس و عدم توانایی تشخیص آن‌ها از یکدیگر است. در صورت استفاده از الکتروفورز در ژلٖ آگارز، نتایجی با رزولوشن پایین حاصل خواهند شد. در آنالیز PCR مالتیپلکس، الگوی ماجرت STR های مختلف نیز مهم است و خصوصا در آنالیزهای دستی، در حال ایده‌آل، الگوی لوکوس‌های مختلف STR نباید با یکدیگر همپوشانی داشته باشد.

امروزه می‌توان با استفاده از کیت‌های تجاری، بیش از ۱۳ آنالیز STR را به صورت همزمان در یک لوله واکنش انجام داد. چنین آنالیزهای چندگانه‌ای الگویی را به دست می‌دهند که حاوی ۲N نوار است و N تعداد لوکوس‌های آنالیزشده می‌باشد. به عنوان مثال، کیت گفته شده، از ۱۳ لوکوس STR، ۲۶ نوار ایجاد خواهد نمود. در صورت هوموزیگوت بودن هر کدام از لوکوس‌ها، تعداد باندهای کمتری مشاهده خواهد شد.

پارامترهای تکثیری PCR در آنالیز STR مشابه PCR استاندارد هستند. البته تعدادی از نکات باید مورد توجه قرار بگیرند. تمامی مراحل باید در شرایط استریل و با استفاده از دستکش، پیپت‌های مقاوم به آیروسل و میز کار استریل با جریان خطی هوا انجام شوند. مقادیر DNA الگو در تکثیر موفق مولکول‌های DNA نقشی حیاتی دارد و باید در محدوده ۱ تا ۲۵ نانوگرم باشد. همچنین باید کنترل مثبتی برای واکنش‌های تکثیری در نظر گرفته شود که در آنالیز DNA در موارد جنایی، از DNA سلول‌های ردیف سلولی K562 استفاده می‌گردد. مورد مهم دیگر، تعداد چرخه‌های تکثیر هر لوکوس STR است. بهتر است به علت افزایش احتمال تکثیر غیراختصاصی، این تعداد از ۳۰ چرخه بالاتر نرود.

PCR-VNTR — تصویر ۳. PCR در علوم جنایی به منظور تمایز افراد از یکدیگر به کار می‌رود. توالی‌های DNA آنالیز شده، STR ها هستند که متشکل از توالی‌هایی مانند CACACA…، GTGTGT… و موارد مشابه می‌باشند. STRها در لوکوس‌های فراوانی از ژنوم انسان یافت می‌شوند. تعداد تکرارهای موجود در هر لوکوس STR در جمعیت، از ۴ تا ۴۰ بار در افراد مختلف متغیر است. به علت تنوع این توالی‌ها، افراد معمولا تعداد تکرارهای متفاوتی را در هر لوکوس STR از پدر و مادر خود به ارث می‌برند. A) پرایمرهای PCR مورد استفاده، مکمل توالی‌های منحصربه‌فردی هستند که در هر دو طرف لوکوس STR مشخصی قرار گرفته اند. در طی فرایند PCR، یک جفت نوار در نتیجه تکثیر مولکول‌های DNA هر فرد حاصل می‌شود، که یکی از آن‌ها نمایانگر واریانت STR مادری و دیگری نمایانگر واریانت پدری است. طول قطعه DNA تکثیرشده و موقعیت آن روی ژل پس از الکتروفورز، بستگی به تعداد دقیق تکرارها در هر لوکوس خواهد داشت. (B) در مثال شماتیک این تصویر، سه لوکوس STR یکسان در نمونه‌های موجود از سه مظنون (افراد A، B و C) آنالیز شده‌اند و ۶ نوار از هر فرد به دست آمده است. با وجود اینکه افراد مختلف، ممکن است در نوارهای فراونی با یکدیگر مشترک باشند، الگوی نهایی حاصل، منحصر به فرد خواهد بود. در نتیجه الگوی نوارها به عنوان اثرانگشت ژنتیکی فرد عمل کرده و تقریبا اختصاصی هر فرد می‌باشد. ستون چهارم (F) حاوی محصولات واکنش PCR ای است که روی نمونه DNA تهیه شده از صحنه جرم انجام گرفته است. این نمونه می‌تواند از یک تار مو و یا قطره بسیار کوچک خون به جا مانده به دست آید. در کیس نشان داده شده در تصویر، افراد A و C از لیست مظانین حذف شده و فرد B تایید می‌شود. در تست ابوت نیز روش مشابهی به کار می‌رود.

احتمالا مهم‌ترین جنبه آنالیز STR های پلی‌مورفیک، تشخیص تفاوت‌های اللی پس از خود PCR است. اساس یکی از مهم‌ترین اشکالات تکنیک‌های قدیمی آنالیز VNTR نیز همین مورد بود: به علت استفاده از تکنیک التروفورز معمولی، که دارای رزلوشن پایینی است، تعداد دقیق تکرارهای موجود در امپلیکون مشخص نمی‌شد و امکان پی بردن به اینکه کدام نوار موجود در الگو متعلق به کدام مولکول هدف PCR است، وجود نداشت. از این رو، نتایج نمی‌توانستند مستقیما بین آزمایشگاه‌های مختلف مقایسه شوند.

این محدودیت امروزه در بسیاری از آزمایشگاه‌ها، با به کارگیری آنالیز بر پایه چیپ میکروفلوئیدی به جای الکتروفورز در ژل آگارز استاندارد حل شده است. با استفاده از توالی‌یاب‌های DNA اتوماتیک و الکتروفورز capillary و نیز لیبل کردن پرایمرها با رنگ‌های فلورسنت مختلف، می‌توان پروفایل‌های STR چندگانه را در یک نوبت آنالیز نمود و در عین حال توالی تک تک آن‌ها را به صورت اتوماتیک تشخیص داد. در بسیاری از موارد، فلوروفور به انتهای ۵’ یکی از پرایمرها متصل شده و به این ترتیب، به داخل محصول القا می‌گردد. البته در صورتی که چنین تجهیزاتی موجود نباشند، هچنان مجبور به استفاده از متدهای شناسایی دستی مانند الکتروفورز در ژل آگارز و PAGE خواهیم بود.

به این ترتیب، در نتیجه این فرایندها توالی‌های STR های آنالیزشده و جایگاه آن‌ها روی کروموزوم را مشخص می‌گردد. هر کدام از نوارها خصوصیات معینی دارند و می‌توانند وارد دیتابیس‌های کامپیوتری و با سایر توالی‌های موجود در دیتابیس‌های رفرنس مقایسه شوند. آنالیز STR مالتیپلکس، اساس دیتابیس ملی تاسیس شده در انگلستان در سال ۱۹۹۵ است. امروزه دیتابیس‌های مشابهی در ایالات متحده (از سال ۱۹۹۸)‌ و سایر کشورهای اروپایی ایجاد شده‌اند.

پیش از آن‌که سیستم‌های جدید آنالیز STR بتوانند در موارد جنایی مورداستفاده قرار بگیرند، باید به صورت گسترده‌ای ارزیابی شوند تا از قابل اتکا بودن نتایج اطمینان حاصل کنیم. در مواردی که مربوط به مطالعه جمعیت هستند، دستورالعمل، بررسی حداقل ۲۰۰ فرد غیرمرتبط و یا ۵۰۰ میوز در هر سیستم STR است تا تعداد دفعات تکرار الل، وراثت مندلی و تعداد جهش‌ها به دست آیند. به علاوه، سیستم PCR مورداستفاده باید بتواند تفاوت‌های اللی را از روی نمونه‌های پیچیده‌ای مانند سلول‌های واژن، منی، بزاق، ریشه مو و خون تشخیص دهد. در واقع باید فرایند استخراج، شرایط ذخیره‌سازی مخلوط PCR و واکنش‌های تکثیری بعدی از لحاظ قابل اتکا بودن و رسیدن به نتایج consistent در سایر نمونه‌ها و افراد، بررسی شود.

VNTR ها

درباره دکتر مجازی

درباره ما