توسعه تست‌هایی که بتوانند متیلاسیون را با دقت بالا و به صورت کمی تعیین کنند، نقش به‌سزایی در آشکار ساختن تاثیر تغییرات اپی‌ژنتیکی در سرطان و تمایز دارد. MS-FLAG نوعی از real-time PCR است که از اندونوکلئاز PspGI به منظور تولید سیگنال فلورسنت استفاده کرده و به منظور تشخیص متیلاسیون DNA آداپته شده است.
مقالات مرتبط:
همان طور که قبلا گفتیم، هایپرمتیلاسیون نابه‌جای پروموتر، مکانیسم اصلی خاموش‌سازی ژن‌های سرکوب‌کننده تومور در سرطان‌های انسانی است. ژن‌های درگیر در تنظیم چرخه سلولی [p16۴ که CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) نیز نامیده می‌شود؛ RASSF1 (Ras association (RalGDS/AF-6)]، آپوپتوز (DAPK, death-associated protein kinase) و ترمیم DNA (MGMT, O-6-methylguanine-DNA methyltransferase)، معمولا در سرطان خاموش می‌شوند. تشخیص وضعیت متیلاسیون این ژن‌ها در نمونه‌های حاصل از جراحی و یا مایعات بدن، روش غربالگری اختصاصی، نسبتا غیرتهاجمی و حساسی را فراهم می‌آورد. هایپرمتیلاسیون CpG می‌تواند به عنوان مارکری مولکولی در تشخیص اولیه سرطان، پیش‌آگهی و تعیین اهداف درمانی به منظور اصلاح متیلاسیون نابه‌جا به کار رود.
تکنیک های فراوانی به منظور آنالیز متیلاسیون DNA در جزایر CpG توسعه پیدا کرده‌اند. یکی از بزرگترین پیشرفت‌ها زمینه تشخیص متیلاسیون DNA در مطالعات اپی‌ژنتیکی، در اوایل دهه ۱۹۹۰ توسط Frommer و همکارانش و با استفاده از سدیم بی‌سولفیت صورت گرفت. سدیم بی‌سولفیت، سیتوزین‌های متیله‌نشده را به یوراسیل تبدیل می‌کند و سیتوزین‌های متیله‌شده دست‌نخورده باقی می‌مانند. در نتیجه، بین ژنوم‌هایی که تنها در وضعیت متیلاسیون CpG خود تفاوت دارند، اختلاف توالی ایجاد می‌شود. تفاوت‌های توالی می‌تواند توسط تعدادی از متدها بررسی شود که از جمله پرکاربردترین آن‌ها، methylation-specific PCR می‌باشد. توضیحات مربوط به MSP را می‌توانید در عنوان مربوطه به طور کامل مطالعه نمایید.
از محدودیت‌های فرمت اصلی MSP، نیاز به الکتروفورز و سنجش کمی endpoint–based است. تکنولوژی‌های Real-time PCR نیز به منظور تشخیص متیلاسیون می‌توانند به کار روند و طی آن‌ها از پروب‌های TaqMan به منظور تولید سیگنال استفاده می‌شود. تکنولوژی Real-time نیاز به تفکیک قطعات توسط ژل را از میان می‌برد و اطلاعاتی کمی مربوط به درجه متیلاسیون DNA را در نمونه موردنظر فراهم می‌کند. این تکنیک‌ها در ظرفیت ورودی و آسانی کاربرد نیز بر MSP برتری داشته و دارای حساسیتی در حد ۱۰۰۰۰/۱ است. با این‌حال، روش‌های بر مبنای TaqMan، گاها نمی‌توانند نمونه‌های متیله‌شده‌ای را که توسط MSP شناسایی شده‌اند، تشخیص دهند. علت این موضوع، نیاز به هیبریداسیون صحیح هر دوی پرایمرها و پروب‌ها به منظور تولید سیگنال است که در نمونه‌های کلینیکی ممکن است همیشه رخ ندهد. به علاوه، مالتیپلکس کردن، در روش TaqMan دشوار است.
اصول تکنیک MS-FLAG
تکنیک MS-FLAG نوعی از تکنیک real-time PCR است که به منظور تشخیص متیلاسیون CpG آداپته شده است و این کار را از طریق تشکیل سیگنال real-time انجام می‌دهد. این تکنیک از پرایمرهایی استفاده می‌کند که انتهای ۳’ شان، اختصاصی توالی هدف و انتهای ۵’ شان دارای دم نوکلئوتیدی متشکل از مجموعه فلوروفور و quencher است. این دو جزء، توسط نوکلئوتیدهای حاوی جایگاه تشخیص اندونوکلئاز PspGI از یکدیگر جدا شده‌اند. PspGI آنزیم محدودکننده‌ای است که استثنائا به حرارت مقاوم بوده و در طول واکنش PCR مقاوم باقی می‌ماند.
پس از اتمام هر چرخه PCR، جایگاه تشخیص کامل و دورشته‌ای این آنزیم در هر دو طرف محصول تکثیرشده ایجاد می‌شود. برش این جایگاه‌ها توسط اندونوکلئاز منجر به جدا شدن فلوروفور از quencher و تولید سیگنال فلورسنت می‌گردد. از آن‌جایی که تنها دم ۵’ متصل‌شده به پرایمر برش می‌یابد، ناحیه اختصاصی پرایمر حفظ شده و می‌تواند در چرخه‌های بعدی به عنوان الگو عمل کند. پرایمرهای MS-FLAG اختصاصی توالی‌های متیله‌شده هستند؛ به نحوی که سیگنال فلورسنت تنها در صورت وجود CpG متیله در نمونه موردبررسی تولید خواهد شد.
سیگنال‌های تولیدی توسط تکنیک MS-FLAG به میزان بالایی اختصاصی، کمی و انتخابی هستند. از محدودیت‌های بالقوه MS-FLAG این است که ناحیه موردتکثیر نباید حاوی جایگاه تشخیص PspGI به جز در انتهای ۵’ پرایمر باشد. این موضوع، کاربرد این تکنیک را محدود به امپلیکون‌هایی می‌کند که خالی از توالی ۵’_CCTGG_3’ باشند. البته در بررسی متیلاسیون، این محدودیت، به علت تیمار شدن نمونه با بی‌سولفیت و برداشته‌شدن سیتوزین ها از جایگاه‌های تشخیص PspGI، مشکل‌ساز نخواهد بود.
در حالت کلی، MS-FLAG حساسیت بالای تکنیک MSP را با راحتی انجام و ظرفیت ورودی بالای real-time PCR ترکیب کرده و مالتیپلکس کردن را نیز نسبت به روش‌های بر پایه TaqMan آسان‌تر می‌کند. این تکنیک می‌تواند در مواردی که طی آن‌ها از real-time PCR استفاده می‌شود، مانند ویروس‌شناسی، تعیین ژنوتیپ و بیماری‌های عفونی کاربرد فراوانی داشته باشد.
