تکنولوژی افکتور نوکلئاز شبه فعال کننده رونویسی، وسیله‌ی نفوذ مصنوعی آنزیم محدود کننده‌ی تولید شده توسط ترکیب افکتور TAL متصل شونده به حوزه DNA، به حوزه برش DNA است.
آنزیم‌های محدود کننده، آنزیم‌هایی‌اند که DNA را در توالی‌های خاصی برش می‌دهند.
افکتورهای شبه فعال کننده‌ی رونویسی (TALEs) می‌توانند سریعا مهندسی شوند تا تقریبا به هر توالی مطلوب در DNA متصل شوند. با ترکیباتی چون: TALE مهندسی شده با DNA حوزه در حال تقسیم (که رشته‌های DNA را میبرد)، می‌توان آنزیم محدود کننده‌ای طراحی کرد که به طور خاص هر توالی دلخواه از DNA را قطع کند. زمانیکه این آنزیم‌های محدود کننده به سلول معرفی شوند، می‌توانند برای ویرایش ژن یا ویرایش ژنوم در آزمایشگاه استفاده شوند، که مشهور به تکنیک ویرایش ژنوم با نوکلئاز مهندسی شده است. در کنار نوکلئاز انگشت روی و پروتيین Cas9، TALEN به یک ابزار برجسته در زمینه ویرایش ژنوم تبدیل می‌شود.
حوزه افکتور TAL متصل شونده به DNA
TAL افکتورها، پروتئین‌هایی‌اند که توسط باکتری Xanthomonas ترشح می‌شوند. حوزه متصل شونده به DNA شامل توالی‌های حفظ شده‌ی ۳۳تا ۳۴ آمینواسیدی از DNA هستند که با آمینواسیدهای ۱۲یا ۱۳ انشعاب می‌گیرند. این دو موقعیت، به عنوان تکرار متغیر diresidue (RVD)، بسیار متغیرند و ارتباط محکمی با تشخیص نوکلئوتید خاص دارند. این ارتباط بین توالی‌های آمینواسید و تشخیص DNA امکان مهندسی حوزه‌های مخصوص متصل شونده به DNA را با گزینش ترکیبی از قطعات تکراری شامل RVDهای مناسب را میدهد.
مقالات مرتبط: انواع ژن درمانی
انتقال ژن: وکتورهای ویروسی
حوزه برش DNA
دامنه غیراختصاصی تقسیم DNA از انتهای اندونوکلئاز Foklمی‌تواند برای ساخت نوکلئازهای هیبریدی که در انواع مختلف سلول فعال‌اند استفاده شود. عملکرد حوزه Fokl به عنوان یک دایمر، نیازمند دو ساختار با حوزه متصل شونده به DNA منحصربفرد برای سایت‌هایی در ژنوم هدف با جهت‌گیری و فاصله گذاری مناسب است. تعداد آمینواسید باقیمانده بین حوزه TALE متصل شونده به DNA و حوزه تقسیم Fokl و تعداد پایه‌های بین دو سایت متصل شونده به TALEN جداگانه، هر دو به نظر می‌رسد پارامترهای مهمی برای دستیابی به سطح بالا از فعالیت هستند.
مکانیسم TALEN
رابطه ساده‌ی بین توالی‌های آمینواسید و تشخیص DNA توسط حوزه متصل شونده به TALE، امكان مهندسی بهینه پروتئین را میدهد. زمانیکه ساختمان TALEN دورهم جمع شود، وارد پلاسمید می‌شود. سپس سلول‌های هدف با پلازمید ترنسفکت و محصولات ژن بیان می‌شوند.در نهایت وارد هسته می‌شود تا به ژنوم دسترسی داشته باشد.
ساختمان TALEN می‌تواند متناوبا به عنوان mRNA به سلول فرستاده شود، که امکان یکپارچگی ساختار ژنومی پروتئین بیان کننده TALEN را از بین میبرد. همچنین استفاده از وکتور mRNA به طور موثری سطح ترمیم مستقیم همولوگ (HDR) و موفقیت ورود حین ترمین ژن را افزایش میدهد.
تکنولوژی TALENمی‌تواند برای ویرایش ژنوم بوسیله تحریک شکاف دو رشته‌ای (DSB) استفاده شود که سلول‌ها با مکانیسم تعمیر به آن‌ها پاسخ می‌دهند. انتهای اتصالی غیر همولوگ (NHEJ) DNA را دوباره از سمتی که شکست دو رشته‌ای صورت گرفته متصل می‌کند، در این قسمت هیچ یا تعداد کمی از توالی‌ها روی هم می‌افتند تا با دوام شوند. این مکانیسم تعمیر با وارد کردن، حذف کردن یا بازآرایی کروموزومی باعث ایجاد خطا می‌شوند، هرگونه خطا می‌تواند باعث ارائه محصولات ژن کد شده در محل غیرعملکردی شود. از آن‌جا که این فعالیت می‌تواند بسته به گونه، نوع سلول، ژن هدف و نوکلئاز مورد استفاده متفاوت باشد، باید در زمان طراحی سیستم برآن نظارت شود. به جای آن DNA را می‌توان از طریق NHEJ در حضور قطعات DNA دو رشته‌ای خارجی، به ژنوم ارائه کرد. همچنین ترمیم مستقیم همولوگ، می‌تواند DNA بیگانه را در DSB به عنوان توالی دو رشته‌ای ترنسفکت شده که به عنوان قالب برای آنزیم‌های ترمیمی استفاده می‌شود، ارائه کند.
برنامه ژن درمانی
برای مثال، تکنولوژی TALEN برای مهندسی کارآمد اصلاح پایدار سلول‌های بنیادی جنین انسان و تحریک سلول‌های بنیادی پرتوان القایی (IPSCs) برای کلن شدن استفاده می‌شود. همچنین این تکنولوژی به صورت تجربی مورد استفاده قرار گرفته است تا خطاهای ژنتیکی که موجب بیماری هستند را اصلاح کند. به عنوان مثال، در آزمایشگاه برای اصلاح نقص ژنتیکی که باعث اختلالاتی چون بیماری سلول داسی شکل،پیگمانتاسیون گزودرما و بیماری پروانه‌ای استفاده می‌شود. همچنین نشان داده شده است که تکنولوژی TALEN می‌تواند به عنوان ابزاری برای مهار سیستم ایمنی بدن برای مبارزه با سرطان باشد. در تئوری، خصوصیات ژنوم در محاسبات TALEN در مهندسی، اجازه اصلاح اشتباهات در مکان‌های ژنتیکی اختصاصی بوسیله ترمیم مستقیم همولوگ با استفاده از یک الگوی خارجی صحیح را میدهد. با این حال در واقعیت، عملکرد داخل سلولی تکنولوژی TALEN، در حال حاضر به دلیل عدم وجود مکانیسم تحویل، فاکتورهای ایمنی ناشناخته و عدم اطمینان در خصوصیت اتصال TALEN، محدود شده است.
یکی دیگر از عملکردهای به وجود آمده‌ی تکنولوژی TALEN توانایی آن در ترکیب با دیگر ابزارهای مهندسی ژنوم، مانند مگانوکلئازها است. محل اتصال DNA در یک افکتور TAL می‌تواند با یک حوزه برش مگانوکلئاز ترکیب شود تا یک معماری هیبریدی ترکیبی از سهولت مهندسی و فعالیت اتصالی DNA بسیار ویژه از یک افکتور TAL با تناوب محلی کم و ویژگی مگانوکلئاز ایجاد کند.
