پیرو مطالب پیشین، در این بخش قصد داریم در مورد کاربردهای اپتوژنتیک در مطالعات مولکولهای دخیل در سیستم عصبی، اطلاعاتی در اختیار شما عزیزان قرار بدهیم.

نورونهای اکسی توسین (OT) یکی از انواع منحصربفرد سلولی هستند که می‌توانند بصورت مستقیم با وکتورهای ویروسی حامل پروموترهای کوتاه OT، مورد هدف قرار گیرند.

تحریک و ثبت فعالیت نورونهای OT

اولین مزیت اپتوژنتیک، کسب دسترسی به جمعیت نورونی مخصوص است. در میان این نورونها، محققان به نورونهای نوروپپتیدرژیک بدلیل سهولت امکان استفاده از قطعات مخصوص پروموتر نوروپپتید موردنظر، علاقه‌ی مخصوصی دارند. استفاده از بیان هدفدار ژن در یک نورون مشخص، طیف وسیعی از ابزارها را برای مطالعه زیرمجموعه‌های مختلف سلولی در مغز، در دسترس قرار می‌دهد. در مورد نورونهای OT، توانایی بیان انتخابی یک پروتئین دوگانه (ChR2mCherry)، متشکل از چنل‌رودوپسین-۲ و یک پروتئین فلورسنت تحت عنوان mCherry، بررسی و دستکاری مدارهای عصبی متشکل از نورونهای OT را آسان‌تر ساخته است.

تحریک نوری هیپوتالاموس و ثبت الکتروفیزیولوژیک فعالیت آن در مطالعات in vitro

بمنظور تحریک نوری نورونهای OT واقع در PVN، وکتور rAAv حامل ژن ChR2mCherry در PVN تزریق می‌شود. دو هفته پس از اینکه ژن مورد نظر در سلولها بصورت کامل بیان شد، حیوان مورد مطالعه کشته شده و مغز آن مطابق پروتکلهای موجود، بصورت قطعه قطعه برش داده می‌شود. سپس PVN در زیر پرتوهای فروسرخ با بزرگنمایی ۴ برابر قرار گرفته و سلولهای OT فلورسنت با استفاده از یک میکروسکوپ فلورسنت، هدف گرفته می‌شوند. در گام بعدی، پاسخ سلولها به نور آبی مورد مطالعه قرار می‌گیرد.

این رویکرد بعنوان یک ابزار منحصربفرد که امکان کنترل دقیق فعالیت نورونهای OT را فراهم می‌آورد، محسوب می‌شود. رویکرد in vitro، شرایط ایده‌آلی را فراهم می‌آورد؛ در این رویکرد، امکان تحریک آکسونهای دوردست بدون احتمال بازگشت پتانسیل عمل بسمت جسم سلولی، وجود دارد. علاوه بر این، این رویکرد، امکان پیاده سازی مطالعات اپتوژنتیکی بهمراه مطالعات دارویی را فراهم می‌آورد.

تحریک نوری هیپوتالاموس و ثبت الکتروفیزیولوژیک فعالیت آن در حیوانات بیهوش شده (مطالعات in vivo)

بمنظور تحریک نوری نورونهای OT واقع در PVN، وکتور حامل ژن ChR2mCherry در PVN تزریق می‌شود (نکته قابل توجه اینکه روش تزریق در این مطالعات با روش تزریق در مطالعات in vitro، کمی تفاوت دارد). دو هفته پس از اینکه ژن مورد نظر در سلولها بصورت کامل بیان شد، حیوانات مورد مطالعه بیهوش شده و در یک قابل استرئوتاکسیک قرار می‌گیرند. تجهیزات مشابه تزریق وکتور ویروسی بمنظور کاشت الکترود نوری، مورد استفاده قرار می‌گیرد.

این رویکرد، مزیت‌های منحصربفردی در دستکاری و ثبت فعالیت نورونهای OT و شبکه‌های عصبی اطراف، فراهم می‌آورد. این رویکرد یک استراتژی ظریف برای مطالعه اثرات اکسی توسین بدون دخالت در شبکه قشری یا هومئوستاز، محسوب می‌شود. در عوض، این رویکرد محیط مناسبی برای انجام مطالعات دارویی بهمراه مطالعات اپتوژنتیک فراهم نمی‌آورد. همچنین در این رویکرد، امکان مطالعه اثرات آزادسازی اکسی توسین درونزاد بر رفتار حیوان، وجود ندارد.

تحریک نوری هیپوتالاموس و ثبت الکتروفیزیولوژیک فعالیت آن در حیوانات آزاد (مطالعات in vivo)

بمنظور فراهم آوردن امکان مطالعه اثرات اکسی توسین درونزاد بر رفتار حیوان، به ثبت فعالیت نورونهای OT در حیوانات آزاد نیاز است. بمنظور نیل به این هدف، پس از تزریق وکتور ویروسی مورد نظر، تترودهای نیکلی بهمراه الکترودهای متصل به فیبر نوری در محل تزریق کاشت می‌شوند که امکان تحریک و ثبت فعالیت نورونهای OT را بصورت همزمان، فراهم می‌آورد.

اتخاذ این رویکرد برای فهم چگونگی واکنش نورونهای OT به تحریک و همچنین ارزیابی چگونگی پاسخ شبکه نورونی اطراف به این تحریک، ضروری است. در نهایت امکان دستکاری فعالیت نورونهای OT بصورت همزمان با ثبت فعالیت آنها، محققان را در فهم اثرات دقیق اکسی توسین درونزاد بر حالات رفتاری، یاری می‌کند.

پایش تاثیر آزادسازی موضعی اکسی توسین بر اهداف دوردست: تحریک نوری طناب نخاعی و ثبت الکتروفیزیولوژیک فعالیت آن در حیوانات بیهوش شده (مطالعات in vivo)

یکی از جذابترین ویژگی‌های اپتوژنتیک، توانایی تحریک آکسون‌های دراز متعلق به یک جمعیت نورونی خاص است. انجام تحریک نوری با برد زیاد بهمراه ثبت الکتروفیزیولوژیک نتایج، نیاز به ترکیبی از تکنیکهای ساده ولی با اهمیت دارد. تمامی این تجهیزات از اهمیت قابل توجهی برخوردار بوده وباید پیش از آغاز پروژه، با دقت کنترل شوند.

محققان از این رویکرد برای تحریک/ثبت فعالیت در ناحیه‌ی کمرب طناب نخاعی، دورترین ساختار مرکزی از هیپوتالاموس، بهره بردند. دسترسی به طناب نخاعی با هدف ثبت فعالیت نورونهای نخاعی در حیوانات آزاد بدلیل پیچیدگی زیاد آن، نیاز به انجام اعمال جراحی قابل ملاحظه‌ای دارد. بهمین دلیل، محققان عمدتا مطالعات ثبت فعالیت in vivo خود را بر روی حیوانات بیهوش شده متمرکز می‌سازند.

همانطور که پیش‌تر ذکر شد، محققان وکتور rAAV حامل ژن ChR2mCherry را به PVN تزریق می‌کنند. در مطالعات طناب نخاعی بدلیل فاصله‌ی تقریبا ۱۰ سانتی متری هیپوتالاموس از ناحیه کمری طناب نخاعی موش بالغ، زمانی نزدیک به ۴ هفته برای بیان سطوح کافی پروتئین مورد نظر در نواحی انتهایی آکسونهای متعلق به نورونهای OT توصیه می‌شود.

در یکی از مطالعات، محققان از تحریک مکرر پاهای پشتی موش بصورت مکرر برای القای wind-up activity در نورون طیف دینامیک وسیع (WDR)، استفاده کردند. پس از ۲۰ ثانیه تخلیه پایدار WDR، پرتوی نور آبی بر طناب نخاعی بمنظور القای آزادسازی اکسی توسین در طناب نخاعی، اعمال گردید. آزادسازی اکسی توسین باعث کاهش شدت wind-up تا حدود ۴۰ درصد گردید. محققان با استفاده از آنتاگونیست گیرنده‌ی اکسی توسین (OTR) و NBQX، قادر به مهار این اثر بودند، ولی آنتاگونیست گیرنده وازوپرسین ۱a باعث مهار این اثر نشد. این یافته نشان می‌دهد اثر اکسی توسین بر پردازش طناب نخاعی درد با گیرنده‌های OTR برخلاف گیرنده‌های وازوپرسین، مرتبط هستند.

این رویکرد از مزیت اپتوژنتیک مبنی بر امکان دستکاری فعالیت آکسونهای بسیار دوردست متعلق به جمعیت نورونی خاص، حداکثر بهره را می‌برد. در حالت کلی اتخاذ رویکردهای مشابه که شامل مطالعه آزادسازی موضعی نوروپپتیدها در سیستمهای in vivo می‌شوند، برای دست یابی به فهم کامل از چگونگی تشکیل شبکه‌های عصبی توسط نورونهای نوروپپتیدرژیک و نحوه تنظیم فرآیندهایی مانند اضطراب، درد و رفتارهای جنسی و مادرانه، الزامی هستند.

برخی از پرسش‌های مرتبط با نوروپپتیدها

کدام یک از مدارهای نوروپپتیدرژیک با رویکردهای اپتوژنتیکی، مورد مطالعه قرار گرفته‌اند؟

اولین گزارشها مبنی بر مطالعه اپتوژنتیکی مدارهای نوروپپتیدرژیک در سال ۲۰۱۲ منتشر شد. تاکنون از نزدیک به ۱۰۰ نوروپپتید شناخته شده، ۵ مدار مغزی نوروپپتیدرژیک با بهره گیری از رویکردهای اپتوژنتیکی مورد مطالعه قرار گرفته‌است: مدار پپتید روده‌ای وازواکتیو یا AgRP و مدار POMC (سال۲۰۱۱)؛ مدار اکسی توسینرژیک (سال ۲۰۱۲)؛ مدار اورکسی‌نرژیک (سال ۲۰۱۳)؛ و مدار گالانین (سال ۲۰۱۴).

با وجود تعداد محدود پپتیدهای مطالعه شده، رویکرد اپتوژنتیکی در این گزارش‌ها یک قالب عملکردی با توجه به مدارها و دخیل بودن آنها در ترس، اشتها، شیردهی، رفتارهای والدی و خواب-بیداری، فراهم می‌آورد.

مکانیسم آزادسازی نوروپپتید چیست؟

سالهای طولانی است که باور بر این است آزادسازی نوروپپتیدها از وزیکل‌های مربوطه، به سطوح کلسیم درون سلولی وابسته است. برخلاف آزادسازی کلاسیک نوروترنسمیتر که به مقادیر بالایی از کلسیم موضعی نیازمند است، آزادسازی نوروپپتید به افزایش گسترده و پایدار کلسیم درون سلولی وابسته است؛ بهمین دلیل، نورونهای پپتیدرژیک به تحریک قوی‌تر/طولانی‌تری برای آزادسازی نوروپپتید نیازمند هستند.

تابش نور آبی باعث ورود حجم گسترده‌ای از کلسیم به درون جسم سلولی و آکسونهای نورونها شده و آزادسازی محتویات وزیکلهای حاوی پپتیدها را تسهیل می‌کند. بنظر می‌رسد آزادسازی نوروپپتیدها تحت تابش نور آبی نسبت به شرایط تحریک فیزیولوژیک طبیعی، شدیدتر است. با این حال، برقراری ارتباط میان تحریک “در بازه‌ی طبیعی” و ورود کلسیم به آکسونهای پپتیدرژیک، به تکنیکهای تصویر برداری نوین با بکارگیری کروموفورهای حساس به pH نیازمند بوده و اطلاعات بسیار اندکی از این موارد در دسترس است.

نوروپپتیدها در کدام ناحیه از مغز آزاد می‌شوند؟

هیچ شواهدی مبنی بر اینکه نوروپپتیدها در محل سیناپسها آزاد می‌شوند، در دسترس نیست. بهمین دلیل، عبارت “فعالیت پس سیناپسی” نوروپپتیدها، که در بسیاری از موارد مورد استفاده قرار می‌گیرد، کاملا درست بنظر نمی‌آید. محققان بدلیل تاخیرهای (در بازه‌ی ثانیه) گزارش شده در زمان آغاز پاسخهای نورون حساس به نوروپپتید، اخیرا مدل “micro-volume” آزادسازی اکسی توسین را در نواحی مغزی مرتبط، مطرح کرده‌اند. با این حال، این امکان که نوروپپتیدها بصورت تصادفی از آکسونها یا بصورت پری‌سیناپسی (در نواحی اطراف سیناپس) آزاد می‌شوند، رد نمی‌شود. با توجه به موارد مطرح شده، آزادسازی micro-volume با انتشار آهسته، اتصال به گیرنده‌های مرتبط با پروتئین G و آغاز آبشارهای درون سلولی، می‌تواند در آغاز اثرات نوروپپتید مورد نظر، دخیل باشد.

آیا نوروپپتیدها باعث تحریک یا مهار نورونهای حساس می‌شوند؟

اثرات مستقیم نوروپپتیدها به ساختار اجزای مهاری (G_i/G_o) یا تحریکی (G_q) گیرنده‌ی مرتبط با پروتئین G بستگی دارد. در مورد اکسی توسین، بیشتر اثرات آن در مغز پیشین بدلیل وجود نورونهای واسطه‌ای گابائرژیک، بصورت تحریکی می‌باشد. در مقابل، نتایج برخی مطالعات نشان می‌دهد اکسی توسین بر روی نورونهای حسی طناب نخاعی از طریق جزء G_i گیرنده، اثر مهاری اعمال می‌کند.

حضور همزمان نوروترنسمیترها و نوروپپتیدها در نورونها به چه معناست؟

نورونهای نوروپپتیدرژیک، نوروترنسمیترهایی مانند GABA و گلوتامات را نیز بیان می‌کنند. در اغلب اوقات، وزیکلهای نورونهای پپتیدرژیک شامل مقادیر زیادی نوروپپتید و/یا نوروترنسمیتر می‌باشد. در نورونهای هسته‌ی سوپرااپتیک (SON)، اکسی توسین به صورت همزمان با انسفالین و داینورفین بیان می‌شود. همچنین نورونهای هسته پاراونتریکولار، اکسی توسین را بهمراه گلوتامات بیان می‌کنند. وازوپرسین، که غالبا بصورت موازی با اکسی توسین مورد مطالعه قرار می‌گیرد، بصورت همزمان با داینورفین، گالانین و پپتید فعال کننده آدنیلات سیکلاز هیپوفیزی (PCAP) در هسته هیپوتالامیک، بیان می‌شود. با توجه به مطالب پیشین، تحریک یک نورون برای آزادسازی نوروترنسمیتر در اغلب اوقات برای آزادسازی نوروپپتیدها از همان نورون، کافی نیست.

در نهایت بعنوان جمع بندی، اپتوژنتیک یک ابزار بسیار قدرتمند برای تشریح مدارهای پپتیدرژیک مغزی فراهم کرده و باعث بالا رفتن سطح پرسش‌های زیست شناختی مرتبط با مکانیسمهای آزادسازی پپتیدها و سیگنالینگ پس سیناپسی شده‌است.