استخراج RNA باکیفیت غالبا مهم‌ترین مرحله در بسیاری از تکنیک‌های مولکولی مانند RT-qPCR، آنالیز ترانسکریپتومیکس با استفاده از توالی‌یابی Next generation، digital PCR، تولید کتابخانه cDNA و … است. از آن جایی که RNA از لحاظ ساختاری بسیار با DNA متفاوت است، تکنیک‌های استخراج DNA نمی‌توانند به طور مستقیم به منظور استخراج RNA مورداستفاده قرار بگیرند.
مقاله مرتبط: تکنیک‌های استخراج DNA
RNA تک‌رشته‌ای است، در حالیکه DNA غالبا دورشته‌ای است. استخراج RNA دشوارتر است؛ زیرا RNaseها در محیط اطراف، به صورت اندوژن در داخل سلول‌ها و به صورت اگزوژن در دست‌ها و سطوح فراوان هستند. زدودن کامل آنها از محیط نیز بسیار دشوار است. از این رو استخراج RNA نیاز به دقت در دستکاری نمونه‌ها و تکنیک‌های پاکسازی مناسب دارد. همچنین مولکول‌های RNA نسبتا کوتاه هستند و حین پاره کردن سلول‌ها کمتر از DNA آسیب می‌بینند؛ درنتیجه می‌توان مرحله تخریب سلول‌ها را با شدت بیشتری انجام داد.
نخستین گام در استخراج RNA، جمع‌آوری نمونه و حفاظت از آن است. استفاده از بهترین متد تخریب سلول‌ها یا بافت‌ها متناسب با نوع نمونه مورداستفاده در به حداکثر رساندن محصول و کیفیت فرایند آماده‌سازی RNA تاثیر فراوانی دارد. بلافاصله پس از انجام گرفتن مرحله تخریب نمونه ماده لیز کننده یا دناتوره کننده باید بتواند در تماس با محتویات سلولی قرار بگیرد. این موضوع همیشه امکان‌پذیر نیست؛ به عنوان مثال در صورتیکه سلول‌ها و بافت‌ها سخت باشند (استخوان)، یا حاوی دیواره سلولی و یا کپسول باشند (اسپورها، مخمرها، باکتری‌های گرم مثبت)، فرایند کار به گونه‌ای باشد که از پردازش نمونه بلافاصله پس از جمع‌آوری آن جلوگیری به عمل آورد (انتقال از محل جمع‌آوری به محلی دیگر به منظور پردازش) و یا زمانی که تعداد نمونه‌ها فراوان باشد و امکان پردازش سریع هر یک از آنها فراهم نشود.
راه‌حل این مسئله معمولا منجمد کردن سلول‌ها و یا بافت موردنظر در نیتروژن مایع و یا یخ خشک است. نمونه‌های منجمدشده غالبا مورد پردازش قرار می‌گیرند تا توده موردنظر انتخاب شود، و یا اینکه قبل از تماس با موادلیزکننده پودر می‌شوند. با اینکه منجمد و سپس پردازش کردن نمونه به محققان امکان کنترل بیشتری روی شرایط خالص‌سازی می‌دهد، تجربه نشان می‌دهد که این فرایندها پیچیده و زمان‌بر هستند و نیاز به نیروی انسانی بیشتری دارند.
راه‌حل بهتر استفاده از محلول‌های پایدارکننده RNA است. با استفاده از این مواد می‌توان استخراج RNA را برای روزها، هفته‌ها و حتی ماه‌ها پس از جمع‌آوری نمونه به تعویق انداخت، بی آنکه ساختار RNA دجار تخریب شود. مقاطع بافتی، مایعات بدن و سلول‌های تهیه شده می‌توانند در داخل این نوع از محلول‌ها قرار بگیرند و با نفوذ این مواد به داخل سلول‌ها پایداری RNA افزایش خواهد یافت.
تهیه RNA
چندین تکنیک به منظور تهیه RNA وجود دارد و این تکنیکها قابل دسته‌بندی در چهار گروه می‌باشند: متدهای استخراج آلی، انواع spin basket، استفاده از ذرات مغناطیسی و تکنیک‌های لیز مستقیم. به منظور انتخاب تکنیک مناسب باید میزان دشواری پردازش نمونه (که با بالا بودن نوکلئازها و وجود مقادیر زیاد چربی در بافت و یا مهارکننده‌ها افزایش می‌یابد)، مقدار نمونه‌ای که باید مورد پردازش قرار بگیرد و ظرفیت ورودی موردنیاز، موردتوجه قرار بگیرد.
تکنیک‌های استخراج ارگانیک
تکنیک‌های استخراج ارگانیک در فرایند تهیه RNA به عنوان gold standard در نظر گرفته می‌شوند. واکنشگر TRIzol به صورتی آسان قابل استفاده است و در عین حفاظت از ساختار RNA حین هموژنیزاسیون بافت، سلول‌ها و سایر ساختارهای سلولی را تخریب می‌کند. از جمله مزایای این تکنیکها دناتوراسیون سریع نوکلئازها و پایدارسازی RNA و نیز scalable بودن آن است. همچنین این فرایند برای تمام انواع بافت‌ها از جانوری تا گیاهی قابل استفاده است. البته این تکنیکها معایبی نیز دارند که از جمله آنها استفاده از مواد آلی کلردار و مواد زاید حاصل از آنها، نیاز به تعداد زیاد نیروی انسانی و پردازش دستی و دشواری اتوماسیون می‌باشد.
از جمله مهم ترین مواد مورد نیاز برای استخراج RNA به این شیوه مورد استفاده قرار میگیرد، واکنشگر TRIzol است. این ماده حاوی فنول، گوانیدین تیوسینات، آمونیوم تیوسینات و بافر سدیم استات می‌باشد. کلروفورم، ایزوپروپرانول، اتانول و لوله اپندورف و دستگاه سانتریفوژ از جمله سایر مواد و تجهیزات موردنیاز هستند. گوانیدین تیوسینات و کلراید از جمله موثرترین دناتوره‌کننده‌های پروتئین می‌باشند و علاوه بر آن مهارکننده شدید ریبونوکلئازها نیز می‌باشند. استفاده از گوانیدینیوم کلرید به عنوان تجزیه‌کننده پروتئین برای نخستین بار توسط Cox و در سال ۱۹۶۸ انجام پذیرفت.
این فرایند هم برای سلول و هم برای بافت قابل استفاده است. در صورت استفاده از نمونه سلولی، حداقل ۱۰۶ سلول باید از کشت سلولی آسپیره شوند و سپس TRIzol افزوده گردد. در صورتیکه نمونه موردنظر بافتی باشد، ابتدا TRIzol و سپس نمونه بافتی منجمد به لوله کشت استریل اضافه می‌شود و بر روی یخ توسط یک هموژنیزه‌کننده پودر می‌شود. در هر دو مورد مخلوط TRIzol و سلول‌های لیزشده به لوله اپندورف اضافه می‌گردد. پس از انکوباسیون در دمای اتاق، کلروفورم افزوده می‌شود و مجددا انکوباسیون انجام میگیرد.
مرحله بعدی سانتریفوژ مخلوط حاصله است. با انجام این کار در هر لوله سه لایه تشکیل می شود: لایه بالایی، صاف و محلول آبی است، لایه حدواسط، DNA است که به رنگ سفید مشاهده می‌شود و لایه پایینی لایه صورتی آلی است. RNA تنها واقع در لایه آبی است. لایه آبی باید به دقت و توسط پیپت برداشته و در داخل لوله اپندورف دیگری ریخته شود. سپس به ترتیب ابتدا ایزوپروپانول افزوده شده و ساتریفیوژ و بعد از آن بیرون ریختن ایزوپروپرانول انجام میگیرد و سپس این مراحل برای اتانول نیز تکرار می‌شود. هدف از انجام این موارد، رسوب RNA و جداسازی DNA و پروتئین است.
در فرایند استخراج RNA باید DNAها و پروتئین‌های موجود تجزیه شوند. تجزیه DNA با استفاده از محلول DNase فاقد RNase و در داخل دستگاه Thermal cycler انجام میگیرد. از آن‌جایی که RNA اتصال محکمی با پروتیئن‌ها دارد، تجزیه پروتئین‌ها نیز باید صورت بگیرد.
تکنیک‌های spin basket با استفاده از فیلتر
در این تکنیکها از غشاهایی استفاده می‌شود که در کف سبد پلاستیکی کوچکی قرار می‌گیرند و جنسشان معمولا از فیبر شیشه‌ای، سیلیکا و غشاهای مبادله کننده یون‌ها است. در این حالت نمونه‌ها توسط بافری که حاوی مهارکننده‌های RNase مانند نمک‌های گوانیدین است، لیز می شوند. با نیروی سانتریفیوژ، نوکلئیک‌اسیدها در اثر گذر نمونه لیزشده از غشا، به آن متصل می‌شوند. سپس یک محلول elution مناسب مورد استفاده قرار میگیرد و نمونه به وسیله سانتریفیوژ در داخل لوله جمع‌آوری می‌گردد.
سهولت استفاده، امکان اتوماسیون، امکان ساخت غشاهایی با ابعاد متفاوت از جمله مزایای این تکنیکها و توقف واکنش توسط تعدادی از مواد، آلودگی توسط نوکلئیک‌اسیدهای بزرگی مانند gDNA، ظرفیت اتصال ثابت (تعیین‌شده توسط تولیدکننده) و نیاز به سیستم های پیشرفته سانتریفیوژ در اثر اتوماسیون از جمله معایب آنها است.
تکنیک‌های استفاده از ذرات مغناطیسی
در این متدها از ذرات کوچکی استفاده می‌شود که حاوی هسته پارامغناطیسی و نیز پوسته‌ای هستند که به مواد موردنظر متصل می شود. ذرات پارامغناطیسی در اثر مواجهه با میدان در داخل آن حرکت می‌کنند، اما پس از حذف میدان این خاصیت را از دست می‌دهند. در نتیجه در اثر فعل و انفعال ذرات با مولکول‌های دلخواه بر اساس ویژگی‌های سطحی‌شان، پس از برقراری میدان الکتریکی خارجی، مواد موردنظر به سرعت جمع‌آوری شده و با از بین رفتن میدان مجددا به حالت شناور دربیایند. در این فرایند نمونه‌ها در محلولی حاوی مهارکننده‌های RNase قرار گرفته و در معرض اتصال به ذرات مغناطیسی قرار داده می شوند. با اعمال میدان مغناطیسی، ذرات مغناطیسی و مولکول‌های مربوطه جمع‌آوری می‌شوند. پس از چندین مرحله RNA در یک محلول elution قرار میگیرد و ذرات متصل‌شده جداسازی می شوند.
عدم وجود خطر مهار شدن فیلتر، جمع آوری سریع مولکول‌های RNA به علت ماهیت مغناطیسی تکنیک، وجود امکان اتوماسیون فرایند، وجود انواع گسترده‌ای از مولکول‌های سطحی از جمله مزایای این تکنیکها و وجود احتمال بقای ذرات مغناطیسی پس از قرارگیری در محلول‌های elution، جابه‌جایی آهسته ذرات مغناطیسی در محلول‌های ویسکوز و نیاز به تعداد زیاد نیروی انسانی در صورت انجام دستی فرایند از جمله معایب آنها است.
تکنیک‌های لیز مستقیم
این تکنیکها مرحله تهیه نمونه را با استفاده از بافرهای لیزکننده‌ای که نمونه را تخریب و نوکلئیک‌اسیدها را پایدار می‌کنند، انجام می‌دهند و با آنالیزهایی که در مراحل بعدی انجام میگیرد سازگار هستند. به طور معمول طی این فرایند نمونه با مواد لیزکننده مخلوط و برای مدتی تحت شرایط مشخص انکوبه می‌شود و سپس به طور مستقیم به منظور آنالیزهای بعدی مورداستفاده قرار میگیرد. در صورت استفاده از این متدها نیاز به اتصال به سطوح جامد و سپس جداسازی از آن ها از بین می‌رود. درنتیجه از خطا و تفاوت در کارایی فرایندهای بازیابی که ممکن است در سایر متدها رخ دهد، جلوگیری به عمل می‌آید.
این متدها داری بالاترین پتانسیل استخراج دقیق RNA می‌باشند، می‌توانند در شرایطی که میزان نمونه اندک است مورد استفاده قرار بگیرند و دارای قابلیت اتوماسیون هستند. عدم امکان انجام متدهای آنالیز قدیمی مانند اسپکتروفوتومتری، وابستگی به غلظت (در نمونه‌های غلیظ بهتر انجام می‌شود)، احتمال عملکرد غیربهینه و احتمال بقای فعالیت RNase در صورتیکه مواد لیزکننده به درستی مهار نشوند، از معایب به کارگیری این تکنیک است.
نکته‌ای که در تمام این تکنیکها باید موردتوجه قرار بگیرد این است که RNA بسیار ناپایدار است؛ درنتیجه تمام واکنش‌گرها و مواد مورداستفاده در پردازش نمونه باید به گونه‌ای مورد استفاده قرار بگیرند که هیچ‌گونه فعالیتی از جانب آنزیم RNase مشاهده نشود. استفاده از دستکش، به‌کارگیری حلال‌های قوی در محلول‌های استخراج (به نحوی که فورا هر گونه RNAای را دناتوره بکنند) و صحبت نکردن در حالتی که لوله‌ها در تماس با بیرون هستند، می‌تواند به میزان زیادی به تهیه مولکول‌های RNA پایدار کمک کند.
