یکی از تکنیک‌هایی که به منظور افزایش کارایی PCR به کار می‌رود، nanoparticle PCR است.این تکنیک برای نخستین بار توسط سه گروه تحقیقاتی معرفی شد: Cui et al. 2004، Li H. et al. 2005 و Li M. et al. 2005. در nanoparticle PCR تعدادی مواد مولکولی کوچک با تعدادی ویژگی فیزیکی خاص به مواد اولیه افزوده می‌شوند تا واکنش PCR را تقویت کنند. در این حالت می‌توان حتی در صورت استفاده از پلیمرازهای ارزان قیمت و مواد اولیه معمولی، کارایی واکنش PCR را افزایش و مدت زمان واکنش را کاهش داد.
مقالات مرتبط:
محققان بسیاری شروع به بررسی مکانیسم nanoparticle PCR و ارزیابی عملکرد آن در فیلدهای مختلف مانند RT-PCR و فعل‌وانفعالات نانوپارتیکل‌ها با سیستم‌های بیولوژیکی هستند. دانشمندان از مدت‌ها پیش می‌دانستند که پروتئین‌های متصل‌شونده به یک‌رشته و DMSO کارایی PCR را افزایش می‌دهند. اخیرا نانومواد فراوانی برای افزایش کارایی PCR به کار گرفته‌شده‌اند که برخی از آن‌ها عبارتند از: نانوپودرهای کربنی، nanoalloyها، quantum dotها، single-walled nanotubeها و multi-walled nanotubeها.
از لحاظ تئوری، در هر چرخه PCR مولکولهای DNA دو برابر می‌شوند. با این حال عواملی مانند تشکیل دایمرهای پرایمر، وجود نواحی غنی از GC در توالی الگو و نسبت گرم و سرد شدن سیستم PCR می‌توانند با کارایی PCR تداخل کنند. در موفقیت PCR دو جزء کلیدی واکنش دخیل می‌باشند: ۱. مواد اولیه PCR مانند توالی الگو، پرایمرها، DNA پلیمراز و یون منیزیم؛ و ۲. چرخه‌های واکنش که در آن‌ها برنامه چرخه حرارتی مهم‌ترین متغیر می‌باشد و به تجهیزات وابسته است.
گرما دادن ترموالکتریکی PCR توسط اثر Peltier و به علت جریان گرمایی بالا و سرعت پایین سرد/گرم شدن دارای محدودیت است. به منظور غلبه بر این محدودیت ماشین‌هایی توسعه یافته‌اند که دارای نسبت سطح به حجم افزایش‌یافته و محتوای کاهش‌یافته‌ای هستند، از جمله capillary PCR و microchip PCR. با این حال، این تغییر توانسته است کارایی PCR را تنها ۵ تا ۱۰ برابر افزایش دهد و محدودیت‌های کارایی گرمایی در این حالت همچنان پابرجاست.
نانوپارتیکل‌ها خصوصیات فراوانی دارند که آن‌ها را از مواد توده‌ای (bulk) متمایز می‌کند. هر چه نانوپارتیکل کوچکتر باشد، کارایی گرمایی آن بالاتر خواهد بود. نانوپارتیکل‌ها در حالت سوسپانسیون در مایعات، می‌توانند جریان گرما را به خوبی منتقل کرده و تعادل گرمایی با محیط را در عرض ۲۰۰-۱۰ پیکوثانیه برقرار کنند. از علل احتمالی این افزایش در انتقال گرمایی عبارتند از: نسبت سطح به حجم بالا، molecular-level layering، اثر nanoparticle clustering و جفت‌شدن الکترون-فونون می‌باشد.
با اعمال این متد، فعالیت تکثیری آنزیم‌های Taq ارزان قیمت در هر دو نوع تکنیک PCR عادی و real-time PCR افزایش می‌یابد. همچنین منحنی سنتز DNA بهتری حین real-time PCR حاصل می‌شود. به عنوان مثال، علاوه بر اینکه مدت زمان PCR به نصف کاهش می‌یابد، وجود ۱۰۰ نسخه در میلی‌لیتر در محصولات real-time PCR ای که کلوئید طلا به آن ها افزوده شده است، قابل تشخیص می‌شود. این در حالی است که این میزان در حالت عادی در حدود ۱۰۶ نسخه در میلی‌لیتر می‌باشد.
نقش کلوئید طلا در PCR
نانوپارتیکل‌های طلا از جمله پرکاربردترین نانوپارتیکل‌ها در بیولوژی و علوم پزشکی است. این ذرات، موثرترین تقویت‌کننده‌های PCR نیز می‌باشند. استفاده از نانوپارتیکل‌های طلا به عنوان تقویت‌کننده PCR برای نخستین بار توسط Haikuo Li و همکارانش مطالعه شد. در این حالت، مدت زمان واکنش کوتاه‌تر شده و تعداد دفعات افزایش و کاهش دما بیشتر می‌شود. از جمله کاربردهای این تکنیک، استفاده از آن به عنوان حامل دارو، تشخیص تومورها، به عنوان بیوسنسور و … است.
Haikuo Li و همکارانش دریافتند که نانوپارتیکل‌های ۱۰ نانومتری طلا با غلظت ۰.۶ مولار در افزایش اختصاصیت PCR بسیار موثر واقع می‌شوند. آنان غلظت‌های متفاوتی از نانوپارتیکل‌های طلا را از ۰.۲ تا ۱.۰ نانومولار بررسی نمودند و دریافتند که باندهای غیراختصاصی با افزایش غلظت نانوپارتیکل‌های طلا به تدریج ناپدید می‌شوند. با این حال غلظت‌های بالاتر از یک نانومولار تولید محصولات PCR را متوقف می‌کرد.
مکانیسمی که این محققان پیشنهاد کردند، توانایی اتصال ssDNA به نانوپارتیکل‌های طلا بود. به منظور حفظ پایداری نانوکریستال‌ها، لایه cappingای که بتواند سطح نانوپارتیکل‌ها را محافظت کند، موردنیاز است. نانوپارتیکل می‌تواند با جذب سطحی سایر مولکولهای ارگانیک می‌تواند biocompatible شده و یا تعدادی از ویژگی‌هایش تغییر یابد. کلوئید طلا از مولکولهای سدیم سیترات به عنوان لایه capping استفاده کرده و می‌تواند ماه‌ها در شرایط استریل نگهداری شود. بافر PCR حاوی ۰.۱ مولار از NaCl و MgCl۲ است که باعث تجمع و رسوب کلوئید طلا می‌شود. به گفته این محققان، افزودن DNA تک‌رشته‌ای (پرایمر) به محلول نمکی می‌تواند با جایگزینی یون‌های سیترات از وقوع این حالت جلوگیری کند.
در سال ۲۰۰۵، Li Min و همکارانش مشاهده کردند که می‌توان با استفاده از نانوپارتیکل‌های طلا، سرعت و حساسیت PCR را افزایش داد. آنان نشان دادند که با حفظ محصولات تولیدشده توسط PCR و یا حتی افزایش آن، می‌توان با افزودن ۰.۷ تا ۱۳ نانومولار نانوپارتیکل طلا به مواد اولیه واکنش، کارایی PCR را به میزان بالایی افزایش و زمان واکنش را کاهش داد. نانوپارتیکل‌های طلا بسته به نوع سیستم PCR مورداستفاده می‌توانند حساسیت واکنش را از ۵-۱۰ برابر در سیستم‌های آهسته و ۱۰۴ برابر در سیستم‌های سریع‌تر مانند real-time PCR افزایش دهند.
نتایج این محققان نشان داد که از اصلی‌ترین عوامل این افزایش در کارایی، ظرفیت انتقال حرارتی بالای نانوپارتیکل‌ها است که می‌تواند در افزایش و کاهش‌های متوالی دمای واکنش کمک‌کننده باشند. به طور مشابهی، علت اینکه ما امروزه از لوله‌های PCRای استفاده می‌کنیم که از نازک‌ترین مواد ساخته شده‌اند، کارایی انتقال حرارتی بالایی دارند و دارای حجم پایینی از مخلوط واکنش هستند نیز همین است. طبق مطالعات آنان، میزان جذب نوری طلا در حالت افزوده‌شدن پرایمر تغییر چندانی نمی‌کند و این موضوع نشانگر آن است که بسیاری از مولکولهای DNA و پرایمرها به کلوئید طلا متصل نمی‌شوند. پس اتصال DNA تک‌رشته‌ای به کلوئید توجیه اصلی افزایش کارایی PCR در صورت استفاده از نانوپارتیکل‌ها نیست و عوامل دیگری در این زمینه موثرتر می‌باشند.
سطح ذرات کلوئیدی طلا، لایه مایع سازمان‌یافته‌ای دارد که منجر به افزایش ظرفیت هدایت گرمایی آن می‌شود. این پدیده منجر به انتقال سریع گرما در DNAهای متصل به ذرات کلوئیدی طلا شده و PCR را در آن نقطه تقویت می‌کنند. به نظر می‌رسد که این مورد از اصلی‌ترین دلائل افزایش کارایی تولید محصولات PCR توسط نانوپارتیکل‌های طلا باشد. نانوپارتیکل‌های طلا به طور استثنائی در پراکنش گرما در چرخه‌های کوتاه PCR کارا هستند. غلظتی از این ذرات که بتواند کارایی PCR را به طور موثری بالا برد، حدود ۰.۷ نانومولار و اندازه آن‌ها حدود ۱۳ نانومتر است. این افزایش کارایی چیزی در حدود ۱۰۴ تا ۱۰۶ برابر در مقایسه با شرایط فاقد نانوپارتیکل است و چرخه حرارتی را نیز با بالا بردن دفعات گرم/سرد شدن، سرعت می‌بخشد.
البته نتایج آن‌ها نتوانست در مطالعه Yang و همکارانش در سال ۲۰۰۸ که real-time PCR وابسته به Taq DNA پلیمراز نوترکیب بود، تکرار شود. این موضوع نشان داد که افزایش کارایی PCR در اثر استفاده از این تکنیک تنها در حالت استفاده از پلیمرازهای استاندارد و یا شرایط گرم/سرد کردن دقیق رخ می‌دهد.
در سال ۲۰۰۸، Vu و همکارانش گزارش دادند که نانوپارتیکل‌های طلا نه تنها اختصاصیت PCR را تغییر نمی‌دهند، بلکه تکثیر محصولات بلندتر را نیز سرکوب کرده و واکنش به نفع تولید محصولات کوتاه‌تر پیش می‌برند. آنان نتیجه گرفتند که عملکرد وابسته به نانوپارتیکل‌های طلا در PCR در اثر فعل و انفعالات سطحی آن با DNA پلیمراز حاصل می‌شود تا تقویت انتقال گرمایی. البته قطعات DNA مورداستفاده در این واکنش همگی طولی کمتر از یک کیلوباز داشتند.
در سال ۲۰۰۹، Shen و همکارانش نشان دادند که نانوپارتیکل‌های طلا می‌توانند اختصاصیت تکثیر مولکولهای DNA به طول ۱۴ کیلوباز را نیز بالا ببرند. این مطالعه به وضوح نشان داد که پس از افزودن نانوپارتیکل‌های طلا به سیستم PCR، هم باندهای غیراختصاصی کوتاه‌تر و هم انواع بلندتر محو می‌شوند. پس nanoparticle PCR با کلوئیدهای طلا می‌تواند وابسته به مولکول هدف عمل کند.
مکانیسم‌های احتمالی تاثیر nanoparticle PCR
این مکانیسم‌ها چندان مشخص نیستند، اما چندین تئوری در مورد نحوه افزایش کارایی PCR توسط nanoparticle PCR وجود دارد:
- جذب سطحی پلیمرازی: این مکانیسم پیشنهادی توسط تیم‌های تحقیقاتی بسیاری تایید شده است. نانوپارتیکل‌های طلا، مقداری از پلیمرازها را جذب کرده و میزان پلیمراز موجود در سیستم را تنظیم می‌کنند که در افزایش اختصاصیت واکنش بسیار اساسی است.
- جذب سطحی پرایمر: نانوپارتیکل‌ها جفت‌پرایمرها را جذب کرده و دمای ذوب دوپلکس تشکیل‌شده میان پرایمرهای کاملا و یا به صورت ناقص جفت‌شده را پایین می‌آورد که منجر به افزایش اختصاصیت واکنش خواهد شد.
- جذب سطحی محصول: نانوپارتیکل‌ها به محصولات PCR مرتبط شده و کارایی مرحله دناتوراسیون و جدایی ذرات از یکدیگر را افزایش می‌دهند.
- انتقال حرارتی بالا: افزایش تمایل واکنش به تولید محصولات کوتاه‌تر: احتمالا نانوپارتیکل‌های طلا اختصاصیت کلی واکنش PCR را افزایش ندهند، بلکه تشکیل محصولات بلندتر را سرکوب کرده و احتمال تولید محصولات کوتاه‌تر را افزایش می‌دهند.
