ژن‌درمانی سندرم آشر

سندرم آشر یک بیماری اتوزومال مغلوب است که با از دست دادن همه یا بخشی از شنوایی و بینایی شناخته می‌شود که در طول زمان بدتر می‌شود. از دست دادن شنوایی به دلیل اختلال در گوش داخلی ایجاد می‌شود و نابینایی آن ناشی از التهاب رنگدانه‌ای شبکیه (RP) می‌باشد. همانند سایر بیماری‌های ناشی از التهاب رنگدانه‌ای شبکیه، ابتدا دید در شب از بین رفته  و سپس به تدریج نقاط کور در کناره‌های میدان دید ایجاد می‌شود. این نقاط کور به تدریج بزرگتر شده و موجب از بین رفتن دید می‌شود (البته بسیاری از افراد مبتلا به RP بینایی در قسمت مرکزی میدان دید باقی می‌ماند).

دید فرد مبتلا به RP (راست) و دید نرمال (چپ)

سندرم آشر براساس شدت ناشنوایی، مشکلات تعادلی و سن شروع علائم به سه نوع  I ،II  و III تقسیم می‌شود که هر یک از آن‌ها نیز براساس علت ژنتیکی به زیرگروه‌هایی تقسیم می‌شوند.

اغلب مبتلایان به سندرم آشر نوع I با ناشنوایی شدید متولد می‌شوند. از بین رفتن پیشرونده‌ی بیماری که ناشی از RP است در دوران کودکی پدیدار می‌شود. این نوع از سندرم آشر همچنین موجب آنرمالی‌هایی در سیستم وستیبولار گوش داخلی شده در نتیجه کودکان مبتلا از نظر تعادل دچار مشکل هستند و دیرتر از سایر کودکان شروع به راه رفتن و نشستن می‌کنند.

مبتلایان به سندرم آشر نوع II نیز هنگام تولد دچار نقص در شنوایی هستند اما بینایی خود را در دوران جوانی یا بزرگسالی از دست می‌دهند. نقص شنوایی از نظر شدت متغییر است و بیشتر توانایی شنیدن صداهایی با فرکانس بالا از بین می‌رود؛ برای مثال شنیدن صداهای نازک و بلند مانند حروف d و t برای شخص مبتلا دشوار است. شدت نقص شنوایی در افراد مختلف یک خانواده متفاوت است و ممکن است با گذشت زمان شدیدتر شود. برخلاف دیگر انواع سندرم آشر، در نوع II آنرمالی در سیستم وستیبولار و بنابراین تعادل شخص وجود ندارد.

در سندرم آشر نوع III نقص در بینایی و شنوایی در سال‌های بعدی زندگی رخ می‌دهد. برخلاف دیگر انواع، در نوع III به طور معمول شنوایی در هنگام تولد نرمال است. نقص در شنوایی در اواخر کودکی یا جوانی (پس از یادگیری تکلم) آغاز شده و با گذشت زمان شدیتر می‌شود. در دوره میانسالی بیشتر مبتلایان نقص شنوایی شدیدی دارند. نقص بینایی ناشی از RP نیز در اواخر کودکی یا جوانی ایجاد می‌شود. برخی افراد مبتلا یه سندرم آشر نوع III دچار آنرمالی‌های وستیوبلار و مشکلات تعادلی می‌شوند.

در اغلب کشورها، سندرم آشر نوع I و II شایع‌ترین فرم هستند. برخی جهش‌های ایجاد کننده سندرم آشر نوع یک در ملیت‌هایی مانند  Ashkenazi (eastern and central European) Jewish or French Acadian شیوع بیشتری دارند. نوع III تنها ۲ درصد از کل سندرم‌های آشر را شامل می‌شود. اگرچه در بین فنلاندی‌ها و Ashkenazi Jewish شیوع آن بیشتر است.
سندرم آشر به دلیل جهش در ژن‌های مختلفی ایجاد می‌شود. حداقل جهش در ۶ ژن سندرم آشر نوع  I را ایجاد می‌کند، شایع‌ترین آن‌ها جهش ژن MYO7A (آشر ۱B) و پس از آن جهش در ژن CDH23 است. سنرم آشر نوع II ناشی از جهش در ۳ ژن است که شایع‌ترین آن USH2A می‌باشد. سندرم آشر نوع III اغلب به دلیل جهش در ژن CLRN1 ایجاد می‌شود.

ژن‌های مرتبط با سندرم آشر ساخت پروتئین‌های درگیر در شنوایی، تعادل و بینایی را کد می‌کنند. در گوش داخلی، این پروتئین‌ها رشد و عملکرد سلول‌های اختصاصی به نام سلول‌های مویی را کنترل می‌کند که برای انتقال صدا و سیگنال از گوش داخلی به مغز ضروری هستند. در شبکیه، این پروتئین‌ها پایداری فتورسپتورهای استوانه‌ای و مخروطی را ایجاد می‌کنند. عملکرد دقیق برخی از پروتئین‌های مرتبط با سندرم آشر در شنوایی، تعادل و بینایی همچنان ناشناخته است.
بسیاری از جهش‌های ایجاد کننده سندرم آشر موجب از بین رفتن سلول‌های مویی در گوش داخلی و از دست رفتن تدریجی فتورسپتورهای مخروطی و استوانه‌ای در شبکیه می‌شوند. تخریب این سلول‌های حسی علت اصلی نقص‌های شنوایی، تعادل و بینایی است.

درحال حاضر برای اختلالات شنوایی از کاشت حلزونی استفاده می‌شود اما برای نقص بینایی هیچ درمانی وجود ندارد. مادرزدی بودن ناشنوایی در اغلب موارد باعث می‌شود سندرم آشر قبل از شروع تخریب شبکیه شناسایی شود، که باعث می‌شود این بیماری کاندید مناسبی برای جایگزینی ژن از طریق ژن‌درمانی باشد.

جایگزیی ژن MYO7A (سندرم آشر ۱B)

وارد کردن DNA حلقوی کدکننده MYO7A سالم، قبل از شروع آسیب شبکیه، می‎تواند به طور موثری از نابینایی جلوگیری کند. برای اثبات اثرگذاری و بی‌خطر بودن این روش درمانی، از سال ۲۰۱۲ کارآزمایی بالینی در کشور آمریکا و فرانسه در حال انجام است. مطالب زیر توضیح مختصری از پژوهش‌های انجام شده در این زمینه است:

موش‌های حامل جهش در Myo7a (ارتولوگ آشر ۱B) با نام shaker1 شناخته می‌شوند. به دلیل حرکت غیرعادی سر، بیش فعالی و رفتار چرخشی خود، که به دلیل نقص در سیستم وستیبولار و حلزونی گوش داخلی است، به راحتی قابل شناسایی هستند.
در شبکیه، MYO7A در لایه رنگدانه‌ای شبکیه (RPE) و فتورسپتورها قرار دارد که بیشترین تجمع آن در قسمت راسی RPE‍ شناسایی شده است. MYO7A یک موتور پروتئینی وابسته به اکتین است. یکی از نقص‌های آشکار و روشی که برای بررسی تاثیر ژن‌درمانی در مطالعات بسیار کاربردی است عدم حضور ملانوزوم‌ها در قسمت راسی RPE است. MYO7A از طریق دو پروتئین ارتباطی (MYRIP و RAB27A) به ملانوزوم‌ها می‌پیوندد. بدون MYO7A (یا هریک از پروتئین‌های ارتباطی) ملانوزوم‎ها قادر نخواهند بود در طول فیلامنت‌های اکتین حرکت کنند و بنابراین در قسمت راسی RPE حضور نخواهند داشت. نتیجه‌ی عدم حرکت و جایگیری اشتباه ملانوزوم‌ها به طور قطعی مشخص نیست اما گفته می‌شود که به هنگام  دریافت نور توسط چشم بیشتر به سمت راس حرکت کرده و عملکرد فاگوزوم‌ها را تسهیل می‌کند. همچنین آنالیز جزئی فتورسپتورهای موش‌های shaker1 توسط میکروسوپ ایمنوالکترونی نشان می‌دهد که MYO7A  انتقال پروتئین اوپسین به غشاء دیسک در قطعه خارجی فتورسپتور را تسهیل می‌کند.

انتخاب و طراحی وکتور مناسب

همانطور که پیشتر توضیح داده شده است وکتورهای AAV به طور گسترده برای ژن‌درمانی بیماری‌های چشم استفاده می‌شوند اما در درمان سندرم آشر انداز ماده ژنتیکی قابل بسته‌بندی در AAVها (کمتر از ۵ کیلوباز)، استفاده از آن‌ها را با چالش مواجه کرده است. MYO7A یک ژن بزرگ به اندازه‌ی ۱۰۰ مگا باز است و cDNA آن حدود ۷ کیلوباز می‌باشد؛ بنابراین استراتژس دیگر یرای انتخاب و طراحی وکتور لازم است. از میان وکتورهای ویروسی، لنتی ویروس‌ها با ظرفیت بسته‌بندی ۱۰ کیلوباز و توانایی آلوده کردن سلول‌های تقسیم ناپذیر(سلول‌هایی که تقسیم میتوز انجام نخواهند داد)، گزینه مناسبی به نظر می‌رسند. ژن‌های انتقال یافته از طریق لنتی ویروس‌ها برای اطمینان از بیان طولانی مدت، داخل ژنوم میزبان اینتگره می‌شوند، این عمل ریسک القای جهش توسط این وکتورها را افزایش می‌دهد.

لنتی ویروس‌های مشتق از HIV: در اواخر سال ۱۹۹۰، نسل سوم لنتی ویروس‌های مشتق از ویروس نقص ایمنی انسان (HIV) پتانسیل بالایی از نظر بی خطر بودن و موثر بودن در انتقال ژن به RPE و فتورسپتورهای جوندگان نشان دادند. در اولین ژن‌درمانی انجام شده برای MY07A نسل سوم مشابهی از لنتی ویروس‌های مشتق از HIV را استفاده شد که به طور خود به خود غیرفعال می‌شدند. بیان ژن در این وکتورها توسط سایتومگالوویروس‌ها (CMV) یا پروموترهای کایمریک القا می‌شد. تزریق تحت شبکیه‌ای این وکتور هم در سلول‌های کشت یافته در آزمایشگاه و هم در ارگانیسم‌های زنده موفقیت‌آمیز بود، فنوتیپ‌های جهش‌یافته اصلاح شده و توزیع اوپسین نیز در موش‌های shaker1 به حالت نرمال بازگشت. اگرچه انتقال و بینا ژن MYO7a در سلول‌های هدف موفقیت‌آمیز بود، سطح بالای بیان پروتئین نگران کننده بود. استفاده از CMV به تنهایی و بدون پرموتر کایمریک به دلیل بیان ژن بسیار بالا سبب مرگ سلول‌های RPE می‌شد. و در استفاده از پروموترهای کایمریک، بیان MYO7A در میان سلول‌های مختلف RPE متفاوت بود و موجب ایجاد الگوی موزائیکی از محل حضور ملانوزوم‌ها می‌شد. این بیان ژن متفاوتِ سلول به سلول نشان دهنده‌ی اینتگره نشدن کامل ژن در سلول‌های میزبان است.
علاوه بر موارد گفته شده، اتقال ژن توسط لنتی ویروس‌ها به فتورسپتورها ناکارآمد است. به خصوص در شبکیه موش که که فتورسپتور با تراکم بالایی قرار گرفته‌اند، یک ویروس نسبتاً نمی‌تواند به آن‌ها دسترسی پیدا کند.

ویروس آنمی عفونی اسب (EIAV)۱: استفاده از EIAV در ژن‌درمانی دژنراسیون ماکولا نشان داد که این وکتورها قادر هستند ماده ژنتکی بزرگی را بسته‌بندی کرده و و به راحتی به فتورسپتورها انتقال دهند.مطالعاتی برای ناتقال DNA حلقوی MYO71 توسط این وکتورهاو به کمک پروموتر CMV، در موش‌ها و میون‌های رزوس انجام شده است. انتقال ژن توسط این وکتورها بیان ژن در RPE و فتورسپتورها را القا می‌کند اما بیان ژن در نواحی ناخواسته مانند قطعات خارجی فتورسپتورها نیز مشاهده می‌شود. نتایج این مطالعه نشان داد که وکتورهای EIAV به تنهایی خاصیت سمیت شبکیه‌ای دارند. به بیان دیگر توزیع زیستی و سمیت این وکتور در بدن میمون‌ها تحمل می‌شود و تزریق یک دوز از آن در داخل بدن پخش نمی‌شود اما سبب پاسخ التهابی موضعی ملایمی در شبکیه می‌گردد.

به طور کلی مطالعات نشان داد که وکتورهای HIV و EIAV می‌توانند برای انتقال MYO7A به RPE و فتورسپتورها مورد استفاده قرار گیرند و هردو این لنتی ویروس‌ها قادرند فنوتیپ‌های جهش‌یافته را اصلاح کنند. اما در مقایسه با وکتور HIV، بیان ژن انتقال یافته توسط EIAV به دلیل ناپایداری رونوشت‌های RNA، در طول زمان کاهش می‌یابد.

۱.  رتروویروس مسبب کم‌خونی عفونی در اسب‌ها که همانند HIV یک لنتی ویروس بوده و از طریق مایعات منتقل می‌شود.